穿心莲内酯对脑出血大鼠脑水肿及AQP4、NKCC1表达的影响

姜燕强，陈俊丽，陈利平，段国华，张 昆，刘亚利，刘 英

脑出血是指非外伤所致脑血管破裂导致的出血，占脑卒中病人的20%左右，具有高发病率、高致残率、高致死率的特点，并且呈现年轻化趋势[1]。研究表明，脑出血后1个月内死亡率超过35%，幸存病人中残疾者超过50%[2]。脑水肿是脑出血主要并发症之一，导致颅内压升高、形成脑疝、脑组织压迫性受损，是导致病人残疾和死亡的主要原因[3]。目前，临床治疗脑出血主要采取药物止血、降压、保护神经及外科手术治疗等，但都不能很好地控制脑水肿。因此，开发新的治疗药物和方法抑制脑出血后脑水肿，对改善脑出血预后具有重要意义。

水通道蛋白(aquaporin，AQP)是一类位于细胞膜上的蛋白质，调控水在细胞的进出。目前，已在哺乳动物体内发现13种AQP，其中AQP4在脑组织含量最为丰富，主要分布在星形胶质细胞足突与脑血管接触处，参与介导水在胶质细胞与血管间的跨膜转运[4]。钠-钾-氯协同转运蛋白(Na+-K+-2Cl-co-transporters，NKCC)有两种亚型，NKCC1和NKCC2，其中NKCC1在大脑神经元和星形胶质细胞中广泛表达，对细胞离子稳态和水转运有重要作用[5]。

穿心莲内酯(andrographolide，AND)是中药穿心莲的主要有效成分，研究表明，穿心莲内酯对多种神经系统疾病具有治疗作用，包括脑外伤、脑梗死、神经退行性病变、脑膜炎，其作用机制与其抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用有关[6-9]。本研究旨在探讨穿心莲内酯对脑出血后脑水肿的影响并探索其机制，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 160只无特定病原体(SPF)级健康雄性SD大鼠，7周龄，体质量220～240 g，购自河北省实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK(冀)2018-004，动物合格号：202004012。分笼饲养1周后进行实验，饲养环境：25 ℃，相对湿度60%～70%，光照黑暗各12 h交替，自由进食和饮水。本实验经武安市第一人民医院医学伦理委员会审核批准。

1.2 药物与试剂 穿心莲内酯购自惠州市九惠制药股份有限公司(批号：20191217)；尼莫地平(nimodipine，NMP)胶囊购自海南普利制药股份有限公司(批号：200125)；伊文思蓝(evans blue，EB)购自国药集团化学试剂有限公司(批号：W20190418)；AQP4、NKCC1、β-肌动蛋白(β-actin)抗体和IgG二抗购自北京博奥森生物技术有限公司(货号：bs-0634R、bs-6945R、bs-0061R、bs-0295G)；异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记二抗购自北京索莱宝生物科技有限公司(货号：SF068)；2，2-联喹啉-4，4-二甲酸二钠(bicinchoninic acid，BCA)、增强型化学发光液(enhanced chemiluminescence，ECL)购自北京博奥森生物技术有限公司(货号：D10616、C05-07004)。

1.3 主要仪器 BN-51700型脑立体定位仪(美国Stoelting公司生产)；微量注射器(上海安亭微量进样仪器厂生产)；SpectraMax M3型多功能酶标仪(美国BioTek公司生产)；H-7650型透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM，日本日立公司生产)；CM1950型切片机(德国Leica公司生产)；Allegra 21R型低温离心机(美国Beckman公司生产)；EG1150型包埋机(德国Leica公司生产)；SE300型蛋白质电泳仪(美国Hoefer公司生产)；VE186型转膜仪(上海天能科技有限公司生产)；BX51TF型荧光显微镜(日本Olympus公司生产)。

1.4 分组、模型制备与给药 采用随机数字表法将160只大鼠随机分为假手术组、模型组、穿心莲内酯 50 mg/kg组和尼莫地平 10 mg/kg组，每组40只。除假手术组外，其他组大鼠均参照文献[10]报道的自体血注射法制备脑出血大鼠模型：禁食禁水12 h后，3 mL/kg腹腔注射10%水合氯醛溶液实施麻醉，经左侧股动脉取血后俯卧位固定于脑立体定位仪，沿正中切开头皮和骨膜、暴露前囟，然后在中线右旁3.5 mm与前囟前0.2 mm交汇处钻孔，通过微量注射器在脑基底节区(深度6 mm)以10 μL/min速度注射50 μL自身股动脉血，无菌骨蜡封闭钻孔，逐层缝合皮肤。造模完成后，尼莫地平 10 mg/kg组给予2 mg/mL尼莫地平溶液(灌胃体积5 mL/kg)灌胃[11]，每日1次；穿心莲内酯 50 mg/kg组给予10 mg/mL穿心莲内酯溶液(灌胃体积5 mL/kg)灌胃，每日1次，其中，大鼠剂量(mg/kg)=[人给药量(mg)/人体重(kg)]×5.61，人体重以60 kg计算；假手术组和模型组给予5 mL/kg生理盐水灌胃，每日1次。各组灌胃7 d。

1.5 采用改良神经功能缺损评分标准(modified Neureological Severity Scores，mNSS)进行神经功能缺损评分 按随机数字表法每组各取8只大鼠，对照mNSS评分标准对大鼠神经功能进行评分[12]，得分越高则说明神经功能缺失越严重。

1.6 脑血肿体积的测定[11]按3 mL/kg腹腔注射10%水合氯醛溶液实施麻醉后，颈椎脱臼处死并迅速断头、剥取脑组织，置于4%多聚甲醛溶液中固定72 h

后，通过高速冷冻切片机、以注射给药针孔为中心连续切片，血肿为暗红色，检测血肿最大层面互为垂直的最大横径和最大纵径长度，根据多田公式计算脑血肿体积，血肿体积=(π/6)×最大横径(mm)×最大纵径(mm)×血肿层数×切片厚度(mm)。

1.7 失重法测定脑含水量 每组按随机数字表法再各取8只大鼠，麻醉后颈椎脱臼处死并迅速断头、剥取脑组织，生理盐水冲洗并拭干，去除小脑和脑干后称重为湿重(W湿)，置于烘箱中100 ℃烘干至恒重后称量为干重(W干)，脑含水量(%)=(W湿-W干)/W湿×100%。

1.8 EB法测定血脑屏障(BBB)通透性 每组按随机数字表法再各取8只大鼠，以4 mL/kg尾静脉注射2%的EB，1 h后以3 mL/kg腹腔注射10%水合氯醛溶液实施麻醉，开胸暴露心脏，按左心室-右心耳通路由快到慢灌注300 mL生理盐水，断头并剥取脑组织，切取右侧半脑、研磨匀浆后加入3倍量甲酰胺溶液(浓度50%)，60 ℃孵育24 h后，3 000 r/min离心10 min取上清液，通过酶标仪检测610 nm波长处吸光度值，根据标准曲线计算脑组织EB含量，脑组织EB含量可反映血脑屏障通透性[13]。

1.9 透射电子显微镜观察血脑屏障超微结构变化 按随机数字表法每组各取8只大鼠，麻醉后颈椎脱臼处死并迅速在冰上取脑组织，经4 ℃生理盐水冲洗干净后，将脑组织置入pH 7.4、浓度3%的戊二醛溶液中固定72 h，4 ℃下经蔗糖缓冲液清洗、1%锇酸固定1 h、乙醇和丙酮混合液梯度脱水后进行包埋，2 μm厚度切片后行苏木精-伊红染色，光镜下观察定位，60 nm厚度超薄切片后，经醋酸铀避光染色10 min、柠檬酸铅染色10 min后，通过透射电子显微镜观察血脑屏障超微结构变化。

1.10 免疫荧光法检测脑组织AQP4、NKCC1蛋白表达 取1.6步骤制备的脑组织冰冻切片，复温后双蒸水冲洗15 min，置于0.01 mol/L柠檬酸修复液中、微波修复5 min，磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗15 min后用山羊血清封闭1 h，分别滴加AQP4、NKCC1一抗4 ℃避光孵育过夜，PBS溶液冲洗15 min后滴加FITC荧光素标记二抗室温避光孵育2 h，PBS溶液冲洗15 min后50%甘油封片，然后通过荧光显微镜观察各组大鼠脑组织AQP4、NKCC1蛋白表达。

1.11 蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测脑组织AQP4、NKCC1蛋白表达 取各组剩余的8只大鼠，麻醉后颈椎脱臼处死并迅速断头、在冰上剥取脑组织，取右脑注射给药针孔周围脑组织，剪碎后加入4 ℃ RIPA裂解液在冰上静置30 min使其充分裂解，4 ℃、3 500 r/min离心10 min取上清液，4 ℃、12 000 r/min离心25 min后取沉淀，BCA法检测总蛋白浓度、沸水浴10 min使蛋白变性后，分别取30 μg蛋白行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨(SDS-PAGE)凝胶电泳(120 V电压50 min，80 V电压40 min)分离蛋白，湿法转聚偏二氟乙烯(PVDF)膜后置于5%脱脂奶粉溶液室温封闭2 h，滴加AQP4(1∶1 000)、NKCC1(1∶1 000)、β-actin(1∶2 000)抗体后4 ℃孵育过夜，洗膜后滴加免疫球蛋白(IgG)二抗(1∶5 000)室温孵育1.5 h，洗膜后滴加ECL显色，以目标蛋白条带灰度值与内参(β-actin)条带灰度值的比值计算目标蛋白相对表达量。

2 结 果

2.1 各组大鼠神经功能缺失评分、脑血肿体积、脑含水量比较 与假手术组比较，模型组大鼠神经功能缺失评分、脑血肿体积明显升高，差异均有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，穿心莲内酯50 mg/kg组和尼莫地平10 mg/kg组神经功能缺失评分、脑血肿体积、脑含水量均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.01)；与尼莫地平10 mg/kg组比较，穿心莲内酯50 mg/kg组神经功能缺失评分、脑血肿体积明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。详见图1。

与模型组比较，＊ P<0.01；与穿心莲内酯50 mg/kg组比较，# P<0.05，△ P<0.01。图1 各组大鼠神经功能缺失评分、脑血肿体积、脑含水量比较(n=8)(A为各组大鼠神经功能缺失评分比较；B为各组大鼠脑血肿体积比较；C为各组大鼠脑含水量比较)

2.2 各组大鼠血脑屏障通透性比较 与假手术组比较，模型组大鼠脑组织EB含量明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，穿心莲内酯 50 mg/kg组和尼莫地平 10 mg/kg组EB含量明显降低，差异均有统计学意义(P<0.01)；与尼莫地平 10 mg/kg组比较，穿心莲内酯 50 mg/kg组EB含量明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。详见图2。

与模型组比较，＊ P<0.01；与穿心莲内酯50 mg/kg组比较，# P<0.01。图2 各组大鼠血脑屏障通透性比较(n=8)

2.3 各组大鼠血脑屏障超微结构比较 假手术组大鼠血脑屏障的基膜结构完整，紧密连接结构(tightjunction protein systerm，TJPs)致密，未见异常；模型组血脑屏障可见基底膜薄厚不均匀、膨大，有断裂现象，紧密连接结构疏松，内皮细胞皱缩等超微结构病变；与模型组比较，穿心莲内酯 50 mg/kg组和尼莫地平10 mg/kg组血脑屏障超微结构病变呈不同程度改善，其中穿心莲内酯 50 mg/kg组效果更为明显。详见图3。

图3 各组大鼠血脑屏障超微结构(×15 000，n=8)(黑色箭头指示为基底膜；橙色箭头指示为紧密连接结构；红色箭头指示为内皮细胞)

2.4 各组大鼠脑组织AQP4、NKCC1蛋白表达比较 与假手术组比较，模型组大鼠脑组织AQP4、NKCC1蛋白表达量明显升高，差异均有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，穿心莲内酯 50 mg/kg组和尼莫地平 10 mg/kg组AQP4、NKCC1蛋白表达量明显降低，差异均有统计学意义(P<0.01)；与尼莫地平 10 mg/kg组比较，穿心莲内酯 50 mg/kg组AQP4、NKCC1蛋白表达量明显降低，差异均有统计学意义(P<0.01)。详见图4～图7。

图4 各组大鼠脑组织AQP4表达免疫荧光图(×100，n=8)

图5 各组大鼠脑组织NKCC1表达免疫荧光图(×100，n=8)

图6 各组大鼠脑组织AQP4、NKCC1蛋白表达条带图(n=8)(A为假手术组；B为模型组；C为穿心莲内酯50 mg/kg组；D为尼莫地平10 mg/kg组)

与模型组比较，＊ P<0.01；与穿心莲内酯50 mg/kg组比较，# P<0.01。图7 各组大鼠脑组织AQP4、NKCC1蛋白表达比较(n=8)

3 讨 论

脑出血是一种起病急、进展快且致残、致死率较高的脑血管疾病，脑水肿引发颅内压升高及继发性脑疝是导致脑出血病人残疾和死亡的主要原因。目前，临床上对于脑出血的治疗方案均不能很好地控制脑水肿，是脑出血治疗中仍待解决的难题[14]。

中医药是具有独特理论及技术方法的医药学体系，具有悠久的应用历史。脑出血在中医属于“中风”范畴，“气虚血瘀、痰瘀阻络”是其主要病机[15]。中医典籍中没有关于脑水肿的确切记载，根据其症状当属于“中风”“真头痛”“痫病”等范畴[16]。但关于脑水肿的相关病机，中医典籍《证治准绳》中记载“瘀则液外渗，则成水也”，《血证论》中记载“瘀血既久，化为痰水”。中药穿心莲以爵床科植物穿心莲干燥地上部分入药，性寒、味苦，具有清热解毒、凉血消肿之功效。穿心莲内酯为穿心莲的主要有效成分，化学结构属于二萜类内酯化合物，具有良好的抗炎活性，目前，临床上主要用于上呼吸道感染、细菌性痢疾的治疗[17]。尼莫地平为钙离子拮抗剂类降压药，是临床防治蛛网膜下腔出血等急性脑血管病的常用药物[18]。本实验采用自体血注射法制备脑出血大鼠模型并给予穿心莲内酯进行治疗，以尼莫地平作为阳性对照药物，研究发现，经穿心莲内酯或尼莫地平治疗7 d能够明显降低脑出血大鼠神经功能缺失评分、脑血肿体积和脑含水量，并且穿心莲内酯组对神经功能、脑血肿体积的影响优于尼莫地平组，提示穿心莲内酯对大鼠脑出血后脑水肿和神经功能损伤具有抑制作用。

脑水肿根据诱发机制可分为两大类：细胞毒性脑水肿和血管源性脑水肿。研究发现，细胞毒性脑水肿在脑出血早期(脑出血后2～24 h)占主导地位，期间主要引发星形胶质细胞水肿，尤其是毛细血管周围的星形胶质细胞足突，也是AQP4高表达位点[4]。黄娟[19]的研究表明，AQP4对细胞毒性脑水肿具有重要的调控作用。Manley等[20]研究发现，AQP4 缺失的小鼠细菌性脑膜炎或局灶性脑缺血等所引起的细胞毒性脑水肿明显减轻。血管源性脑水肿在脑出血晚期(脑出血24 h后)占主导地位，引发细胞间隙肿胀，与血脑屏障通透性增加密切相关[21]。血脑屏障是存在于脑组织与血液间的一道选择性生理屏障，能够阻止水溶性及部分脂溶性物质进入脑组织，对维持脑内环境稳态具有重要作用。病理学研究发现，脑水肿组织中AQP4表达明显上调，其参与各种原因所致脑水肿的形成[22]。魏二佳等[23]研究表明，AQP4表达量与脑含水量变化呈正相关，AQP4参与脑出血所致脑水肿的形成过程。NKCC1过度表达将会导致细胞肿胀和组织水肿，Gong等[24]研究发现，抑制NKCC1则能够减轻脑水肿。本研究结果显示，脑出血模型大鼠血脑屏障通透性明显升高，血脑屏障可见基底膜薄厚不均匀、膨大、断裂现象，紧密连接结构疏松，内皮细胞皱缩等超微结构病变，与王丽琴等[25]研究报道一致。进一步研究发现，经穿心莲内酯或尼莫地平治疗7 d能够明显降低脑出血大鼠血脑屏障通透性，明显改善血脑屏障超微结构病变，明显降低脑组织AQP4、NKCC1表达，与王桥生等[26]研究报道一致，并且穿心莲内酯上述作用优于尼莫地平组，提示穿心莲内酯对脑出血大鼠脑水肿的抑制作用可能与下调AQP4和NKCC1表达、降低血脑屏障通透性有关。

综上所述，穿心莲内酯具有减轻脑出血大鼠脑水肿的作用，其机制可能与下调AQP4和NKCC1表达、降低血脑屏障通透性有关。本研究结果提示，穿心莲内酯可作为脑出血的治疗药物，但AQP4、NKCC1对血脑屏障通透性的影响机制还有待于进一步研究。