新生小鼠与成年小鼠心肌环状RNA差异表达分析

贾笑冬， 于海波， 宋海旭， 桑占发， 梅 竹， 刘 晶， 闫承慧

1.北部战区总医院 心血管内科，辽宁 沈阳 110016；2.解放军三二二九五部队 检验病理科，辽宁 辽阳 111000

成年哺乳动物心肌细胞失去再生能力是心脏组织发生损伤无法自我修复的根本原因，也是心肌梗死等疾病导致心脏衰竭甚至死亡的关键原因［1］。尽管有研究发现成年心肌存在再生潜能［2］，但在大多情况下，成熟心肌的再生能力十分有限，或处于关闭状态，难以满足病理情况下心肌增殖修复的需要［3］。阐明成熟心肌增殖再生功能的调控机制，有效诱导损伤的心脏组织通过内源性心肌细胞增殖进行修复，是心血管疾病研究面临的一项重要挑战。有研究证实，新生24 h内的小鼠心肌细胞仍具有良好的增殖能力［4］。然而，出生7 d后，随着心肌细胞成熟，新生小鼠（乳鼠）心肌细胞的增殖能力就会丧失。从遗传学角度分析，成年小鼠（成鼠）与乳鼠具有完全相同的基因组信息，因此，影响心肌细胞再生功能的调控开关应该主要在基因转录调控或转录后调控中［5］。环状RNA（circular RNA，circRNA）通过与关联的微小RNA（microRNA，miRNA）相互作用，circRNA在病理生理过程中发挥重要作用［6-9］。目前，关于心肌细胞增殖能力调控相关的circRNA报道较少。基于此，本研究应用乳鼠和成鼠的心脏组织进行了全转录组芯片的大数据分析，旨在寻找差异表达的circRNA及其转录调控网络的关键分子。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 收集新生24 h内的雄性C57BL／6J乳 鼠和8周龄C57BL／6J雄性 成 鼠 各3只。C57BL／6J小鼠购自集萃药康实验动物技术有限公司。动物实验得到北部战区总医院实验动物伦理委员会批准认可。实验动物造模于北部战区总医院全军重点实验室完成。

1.2 心脏组织标本收集 将小鼠麻醉，采用眼科剪打开胸腔，摘取心脏，去除心耳。应用生理盐水灌注冲洗后吸干水分。将标本放置到含有2 ml Trlzol试剂的15 ml离心管中保存。

1.3 RNA提取 在TRIzol试剂中剪碎心脏组织，4℃、12 000r／min离心2 min。将匀浆混合液转入新EP管中，加入400μl的三氯甲烷，剧烈混匀，4℃、12 000 r／min离心15 min；分离上层RNA移至新EP管中，1:1加入异丙醇，4℃、12 000 r／min离心15 min。弃上清，加入1 ml预冷的75%乙醇重悬沉淀；4℃、12 000 r／min离心15 min，弃上清，加入适量DEPC水溶解RNA。Nanodrop 2000测RNA浓度，评价RNA的完整性。

1.4 芯片分析 Agilent-085631 RNA芯片及数据分析由博淼生物有限公司（Bio Miao Biotechnology Co.，Ltd.中国北京）进行。将总RNA逆转录为双链cDNA，合成为cRNA并用Cyanine-3-CTP标记后，进行微阵列杂交，用安捷伦扫描仪G2505C（Agilent Technologies）扫描阵列。应用功能提取软件（10.7.1.1版，安捷伦科技公司）分析阵列图像以获取原始数据。使用Genespring（14.8版，Agilent Technologies）完成原始数据的基础分析。通过倍数变化以及t检验计算P值。上调和下调基因的阈值设置为倍数变化≥2.0，P≤0.05。使用GO分析和KEGG分析确定差异circRNA的生物学功能。基于该物种所有已知miRNA（数 据 来 源 于miRBase V22），应 用miranda程 序［10］预测circRNA序列上可能结合的miRNA，选择结合能量＜-20 J的已知功能miRNA进行相关分析。

2 结果

2.1 实验数据变异情况及相关性 根据芯片的探针重复分别计算质控点和非质控点的CV值，取对应的中位值及表示芯片的变异系数，判断不同样本的检测结果检测体系是否稳定，一般CV值要求低于15%。本次检测结果中平均CV值为8.16%，最大CV值为9.61%，提示基因芯片检测成功。进一步应用Pearson Correlation检验分析样本间相关性和主成分，两组样本的分布良好，组内CV小。见图1。

图1 两组样本的主成分分布图

2.2 circRNA差异表达情况分析 根据分组情况对数据进行过滤并根据对应的阈值（差异倍数＞2，P＜0.05）分别进行差异circRNA筛选，结果显示，乳鼠circRNA表达上调38个，circRNA表达下调1个。对差异基因进行非监督层次聚类，区分两组或多组样本（图2a）。应用火山图和散点图展示差异表达circRNA的差异倍数及P值分布情况（图2b、图2c）。

图2 差异表达circRNA的分布情况（a.乳鼠和成鼠circRNA差异表达的聚类分析图；b.乳鼠和成鼠circRNA差异表达的散点图；c.乳鼠和成鼠circRNA差异表达的火山图）

2.3 差异表达circRNA的宿主基因富集分析 本研究仅对差异表达上调的circRNA宿主基因进行GO富集分析和KEGG分析。GO富集分析显示，上调表达的circRNA主要与蛋白激酶和RNA相关蛋白的反向激活调控有关，而这些宿主基因最主要的信号转导调控通路与有丝分裂调控、流体力学调控和硫基代谢调控有关（P均＜0.001）。见图3。

图3 GO富集分析及KEGG信号转导调控分析（a.GO富集分析；b.KEGG分析）

2.4 差异表达circRNA的互作调控miRNA分析 根据芯片分析结果，获取差异表达倍数＞5的circRNA共有5个，分别是上调表达的mmu-circ RNA-0001016、mmu-circRNA-0000126、mmu-circRNA-0000663、mmu-circRNA-0000914和下调表达的mmu-circRNA-0001718。见表1。

表1 差异表达circRNA及互作miRNA分析

3 讨论

细胞死亡期作为急性心肌梗死的关键病理分期，贯穿于整个急性心肌梗死损伤修复过程［11-12］。circRNA作为一类新型的非编码RNA，在心肌细胞增殖调控中可能发挥基础性作用，有望成为急性心肌梗死后促进心肌细胞增殖的潜在靶点。与传统的线性RNA不同，circRNA分子呈封闭环状结构，由外显子序列构成，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。功能研究发现，大部分circRNA分子上富含miRNA结合位点，在细胞中起到miRNA海绵的作用，通过解除miRNA对靶基因的抑制作用改变靶基因的表达水平，这一作用机制也被称为竞争性内源RNA［13］。本研究发现，circRNA-0001016、circRNA-0000126和circRNA-0000663对目前已知的可能参与细胞周期调控的miRNA家族成员miRNA-15、miRNA-34a和let7有相互作用，提示这些circRNA可能通过竞争性内源RNA方式发挥了对心肌细胞增殖的转录调控功能。其中，mmu-circRNA-0000914涉及的与增殖有关的miRNA最多，包括既往研究报道的与心肌细胞增殖能力调控密切相关的miRNA-195和miRNA-294［14-15］。此 外，mmu-circRNA-0001718表达下调，且与心肌细胞增殖的负性调控分子miRNA-128有着明显的相互作用，这些差异表达显著的circRNA可能通过调控miRNA抑制细胞增殖，进而导致各种心律失常、心肌重构和心衰等永久性心肌损伤的发生。

综上所述，与成鼠心肌组织比较，乳鼠存在显著差异表达的circRNA，这些差异表达显著的circRNA可能通过调控miRNA抑制细胞增殖。阐明并进行关键circRNA的调控研究，有可能为心肌细胞增殖的干预研究提供实验证据。