五味子果实和叶中7种成分的比较
2022-07-06吴亚楠问思华赵重博
吴亚楠，问思华，武 旭，赵重博，3，刘 航，孙 静，3*
1.陕西中医药大学，咸阳 712046；2.陕西中医药大学附属医院，咸阳 712046；3.陕西省中药饮片工程技术研究中心，咸阳 712046
五味子为木兰科植物五味子的干燥成熟果实，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功效，用于久嗽虚喘、梦遗滑精、遗尿尿频、久泻不止、自汗盗汗、津伤口渴、内热消渴、心悸失眠的治疗［1］。传统用法以果实入药［2-4］，但随着对五味子研究的深入，发现五味子叶与果实所含成分相似［5-7］，有良好的利用价值。为了探讨五味子叶是否有药用价值，如何使用、如何实现五味子资源的合理开发，本文对五味子叶进行研究，通过7种成分含量的测定并与五味子果实进行对比，为五味子叶的质量评价提供理论依据，同时为五味子的综合开发、利用奠定基础。
1 仪器与试药
1.1 仪器
LC-2030 Plus型高效液相色谱仪（配置LC-2030 LC-2030 UV 检测器，日本岛津公司）；New Classic MS-S型电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；XM-P102 H 型无极调功超声波清洗机（昆山超声仪器有限公司）；0.22μm 微孔滤膜（天津杉羽科技有限公司）；UPL-10L 型超纯水机（四川卓越水处理有限公司）。
1.2 试药
五味子、五味子叶由柞水县世纪生态农业有限公司提供，经孙静教授鉴定为木兰科植物五味子的果实与叶。五味子甲素（批号PS000928，质量分数为99.02%），五味子乙素（批号PS010450，质量分数为99.62%），五味子丙素（批号PS020290，质量分数为99.62%），五味子醇甲（批号PS011670，质量分数为99.90%），五味子醇乙（批号PS010166，质量分数为99.83%），五味子酯甲（批号PS000936，质量分数为99.55%），五味子酯乙（批号PS010169，质量分数为99.16%），均购自成都普思生物科技股份有限公司；乙腈为色谱纯；其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）。流动相：乙腈（A）-水（B）。梯度洗脱：0～20 min，45%～55% A；20～30 min，55%～60% A；30～40 min，60%～65% A；40～60 min，65% A；60～70 min，65%～75% A；70～80 min，75%～85%A；80～90 min，85%～95%A；90～100 min，95%～100%A）。流速：0.5 mL·min－1。检测波长：254 nm。柱温：40℃。进样量：10μL。
2.2 供试品溶液的制备
取五味子果实、叶样品粉末（过3号筛）约0.3 g，精密称定，置于25 m L 量瓶中，加甲醇约20 m L，称定质量，超声处理（功率250 W，频率20 k Hz）20 min，取出，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得［1］。
2.3 对照品溶液的制备
精密称取各对照品适量，置于10 m L 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成五味子丙素、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素质量浓度约为0.1 mg·m L－1的混合对照品溶液。
2.4 线性关系考察
分别精密称定五味子甲素、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素约10 mg，分别置于1 m L 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制成高质量浓度对照品溶液。精密吸取各高质量浓度对照品溶液，置于5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制成各对照品质量浓度为1 mg·m L－1的混合对照品溶液。再逐级稀释成质量浓度分别为0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.002 mg·mL－1的混合对照品溶液，以质量浓度为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线。取质量浓度为0.002 mg·mL－1的混合对照品溶液逐级稀释，分别以信噪比（S／N）为3和10 时的对照品质量浓度为检测限（limit of detection，LOD）和 定 量 限（limit of quantitatio，LOQ）。结果见表1。
表1 各成分的回归方程、相关系数、线性范围、检测限和定量限Tab.1 Regression equation，correlation coefficient，linear range，LOD and LOQ for each component
2.5 精密度实验
取混合对照品溶液，按照2.1项下色谱条件，连续进样6次，五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙峰面积 的RSD 值 分 别 为0.27%、0.25%、0.29%、3.00%、0.62%、0.29%、0.28%。
2.6 重复性实验
分别精密称取五味子果实、叶各6 份，每份约0.3 g，按照2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样分析。五味子果实中五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙质量浓度的RSD 值分别为2.71%、0.92%、0.51%、0.38%、0.74%、0.55%、1.23%。五味子叶中五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙质量浓度的RSD 值分别为0.64%、0.88%、0.8%、1.17%、0.86%、0.54%、0.47%。表明该方法的重复性良好。
2.7 稳定性实验
分别取五味子果实、叶供试品溶液，分别在、2、4、6、8、10、12、24、48 h进样分析。五味子果实中五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙质量浓度的RSD 值 分 别 为0.15%、0.43%、2.15%、1.34%、0.29%、0.33%、0.52%。五味子叶中五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙质量分数的RSD 值分别 为0.98%、0.56%、2.86%、1.35%、2.13%、1.22%、0.32%。表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.8 加样回收率实验
分别精密称取已知成分含量的五味子果实、叶样品粉末，各6份，每份约0.15 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，分别精密加入各对照品适量，按照2.1项下方法制备供试品溶液，按照2.2项下色谱条件进样分析。结果见表2、表3。
表2 五味子果实加样回收率结果Tab.2 Results of recovery tests of Schisandra fruits
表3 五味子叶加样回收率结果Tab.3 Results of recovery tests of Schisandra leaves
2.9 含量测定
取五味子果实、叶，按照2.2项下方法制样，按照2.3项下色谱条件进样分析，计算五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子醇甲、五味子醇乙的含量。结果见表4。混合对照品、五味子果实、叶色谱图见图1。
图1 HPLC图Fig.1 HPLC chromatograms
表4 各成分含量Tab.4 Content of each composition
3 讨论
实验分别考察了将甲醇和乙腈作为流动相对分离效果的影响，结果显示，乙腈-水分离系统的分离效果好，最终确定以乙腈-水分离系统作为流动相；考察不同梯度流动相对分离效果的影响，确定最佳流动相梯度，但有2个化合物分离效果不好。
通过对柱温进行调整，结果显示，在柱温为40℃时，分离效果最好，确定以此条件进行后续的实验。
五味子具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功效，具有很好的保健开发潜力，其中五味子甲素、五味子酯甲具有保肝、抗炎的功效［8-10］，五味子乙素具有抗炎、抗氧化的作用［11-16］，五味子丙素、五味子酯甲具有调节肝脏药物代谢的作用［17-19］，五味子醇乙具有保肝的作用［20-21］。通过对7种成分含量的测定可知五味子果实与叶的化学成分相似，但含量相差悬殊，可见五味子叶的药用价值较低，仅可作为保健品开发使用。
