响应面法优选青牛胆块根中药根碱和盐酸巴马汀的提取工艺

刘旭阳，张 慧，王仕宝，魏晓琴，向 仪

1.汉中市南郑区食品药品检验检测中心，汉中 723000；2.汉中职业技术学院药学院，汉中 723000；3.汉中职业技术学院秦巴山区药（食）用植物研究所，汉中 723000

青牛胆［Tinospora sagittata（Oliv.）Gagnep.］来源于防己科青牛胆属植物，分布于湖北西部和西南部、陕西南部、四川东部至西南部等地区［1］。青牛胆以块根入药，中药名金果榄，收载于2020年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》），具有清热解毒、利咽止痛的功效［2］。青牛胆属植物的化学成分主要有生物碱类、甾酮类、萜类、苯丙素等化合物［3-5］。现代药理学研究表明，青牛胆属植物具有多种药理活性，心叶青牛胆具有抗氧化、抗菌、抗毒、抗应激、降血脂、降血糖、抗癌等作用［3］，海南青牛胆具有抗骨质疏松、抗炎、抗菌、止痛、肌肉松弛和促进血液循环的作用［6］，波叶青牛胆在安全剂量范围内，可降低糖尿病肾病小鼠的血糖及总胆固醇，并改善其肾功能状态［7］，宽筋藤具有抗炎［8］及抗辐射的作用［9］。临床常用于咽喉肿痛、痈疽疔毒、泄泻、痢疾、脘腹疼痛等症的治疗［10］；并且其在毒蛇咬伤［11］、糖尿病和卵巢癌治疗等方面也表现出一定的疗效［4］。药根碱和巴马汀为小檗碱类生物碱，是青牛胆块根中的重要成分。小檗碱类生物碱生物活性多样，具有抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗炎以及调节心血管系统和神经系统的作用，在抗菌消炎、止泻止痢方面有独特的作用［12］。本文基于高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC），用响应面法优选青牛胆块根中药根碱和盐酸巴马汀的最佳提取工艺，可为青牛胆中小檗碱类生物碱的检测及开发、利用提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1260B型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；UV-1900PC型紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；XFB-200型高速中药粉碎机（吉首市中诚制药机械厂）；DS-8510DTH 型超声清洗器（上海生析超声仪器有限公司）；ESJ50-5型电子天平（德国赛多利斯公司）。

1.2 试药

对照品：药根碱（编号Z05D10X104878，质量分数为98%），盐酸巴马汀（编号Z16J10X79792，质量分数为98%），均购自上海源叶生物科技有限公司；乙腈（色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司）；甲醇（色谱纯，天津光复精细化工研究所）；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

青牛胆块根于2020年4月15日采于陕西省汉中市宁强县，经王仕宝副教授鉴定为防己科青牛胆［Tinospora sagittata（Oliv.）Gagnep.］的块根；在采集到的青牛胆块根样品中，选取大小适中者，常温干燥后保存；实验前粉碎，过3号筛，密封备用。

2 方法

2.1 色谱条件

Agilent Extend-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；以乙腈为流动相A、3 m L·L－1的磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱程序见表1；检测波长：225 nm；流速：1.0 m L·min－1；柱温：25℃。

表1 流动相梯度洗脱程序Tab.1 Mobile phase gradient program

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取盐酸巴马汀、药根碱对照品适量，置于量瓶中，用甲醇定容，配制成盐酸巴马汀、药根碱的终质量浓度分别为165.6、115.6μg·m L－1的混合对照品溶液，置于4℃保存，备用。

2.3 供试品溶液的制备

取青牛胆块根粉末约1.0 g，精密称定质量，置于锥形瓶中，精密量取20 m L 体积分数为70%的乙醇加入锥形瓶中，精密称定质量，回流提取40 min，冷却，放冷后用体积分数为70%的乙醇补足减失的质量，摇匀，静置，取上清液过0.22μm 微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.4 线性关系考察

依次精密量取混合对照品溶液0.4、2.0、4.0、6.0、8.0m L，置于10 m L 量瓶中，加甲醇定容，用0.22μm 微孔滤膜过滤，依次进样10μL，按照2.1项下色谱条件测定峰面积，见图1。以药根碱峰面积为纵坐标（y）、对照品质量浓度为横坐标（x），绘制标准曲 线，回 归 方 程 为y1＝43.803x1＋26.66，R2＝0.999 6。结果表明，药根碱质量浓度在4.624～92.48μg·m L－1范围内，与峰面积呈良好的线性关系。以盐酸巴马汀峰面积为纵坐标（y）、对照品质量浓度为横坐标（x），绘制标准曲线，回归方程为y2＝39.914x2－25.557，R2＝0.999 9。结果表明，盐酸巴马汀质量浓度在6.624～132.48μg·m L－1范围内与峰面积呈良好的线性关系。

图1 HPLC图Fig.1 HPLC chromatograms

2.5 精密度实验

按照2.1项下色谱条件，取对照品溶液重复进样6次，测得药根碱和盐酸巴马汀峰面积的RSD 值分别为0.78%、0.72%，表明仪器的精密度良好。

2.6 稳定性实验

取供试品溶液，按照2.1项下色谱条件，于2、4、8、10、12、24 h分别测定药根碱和盐酸巴马汀的峰面积，计算得峰面积的RSD 值分别为1.18%、0.74%，表明样品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性实验

精密称取同一样品5份，按照2.3项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件测定药根碱和盐酸巴马汀的峰面积。计算得峰面积的RSD 分别为1.9%、1.8%，表明方法的重复性良好。

2.8 加样回收实验

取青牛胆样品粉末0.5 g，共6份，精密称定，精密加入药根碱和盐酸巴马汀对照品适量，按照2.3项下方法制备供试品溶液，进样10μL，按照2.1项下色谱条件测定，分别计算药根碱和盐酸巴马汀的平均加样回收率和RSD 值。结果见表2。由表2 可知，药根碱和盐酸巴马汀的平均加样回收率分别为101.6%、102.6%，RSD 值分别为1.51%、1.11%。

表2 药根碱、盐酸巴马汀加样回收率实验结果Tab.2 Results of recovery test of jatrorrhizine and palmatine hydrochloride

2.9 单因素实验

考察了浸渍法、回流提取、超声提取对青牛胆块根中药根碱和盐酸巴马汀提取量的影响。结果显示，回流提取的效果较好，故本实验选择回流提取进行操作。以药根碱和盐酸巴马汀提取量之和为考察指标，采用单因素法分别对提取溶剂、液料比、提取时间3个因素进行考察。

2.9.1 提取溶剂 在参照文献中方法的基础上，分别以不同体积分数的甲醇、乙醇为提取溶剂，固定液料比20∶1，加热回流提取40 min，制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进行药根碱和盐酸巴马汀含量的测定。结果表明，将体积分数为70%的乙醇、体积分数为70%的甲醇作为提取溶剂时提取量较高，考虑到乙醇较为安全、经济、环保，故选择将体积分数为70%的乙醇作为提取溶剂。见表3。

表3 提取溶剂对药根碱和盐酸巴马汀提取量的影响（n＝3）Tab.3 Effect of extraction solvent on the extraction amount of jatrorrhizine and palmatine hydrochloride（n＝3）

2.9.2 液料比

以体积分数为70%的乙醇作为提取溶剂，加热回流提取30min，考察液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1对青牛胆药根碱和盐酸巴马汀的提取量的影响。结果表明，当液料比为20∶1时，提取量达到最大值。

2.9.3 提取时间 以体积分数为70%的乙醇作为提取溶剂，料液比为20∶1，加热回流提取20、40、60、90、120 min，考察不同提取时间对青牛胆块根中药根碱和盐酸巴马汀提取量的影响。结果表明，提取时间为40 min时，青牛胆块根中药根碱和盐酸巴马汀的提取量达到最大值。

2.10 响应面法设计

2.10.1 响应面法设计与结果分析 根据上述单因素实验结果，用响应面软件Design Expert 11.0设计方法，以影响青牛胆块根中药根碱和盐酸巴马汀提取工艺的4个显著因素（溶剂体积分数、液料比、提取时间和次数）为自变量、青牛胆块根中药根碱和盐酸巴马汀的提取量之和（y）为响应值，进行响应面分析［13-15］。因素与水平设计见表4，结果见表5。

表4 因素与水平Tab.4 Factors and levels

表5 响应面分析方案及结果Tab.5 Response surface analysis scheme and results

将表5中的数据输入Design Expert 11软件进行多元回归拟合，得到青牛胆块根中药根碱和盐酸巴马汀提取量与各因素变量的关系方程：y＝1.4－0.233 3A＋0.022 0B＋0.014 0C＋0.020 2D－0.008 7AB＋0.021 0AC－0.036 2AD－0.025 2BC＋0.040 5BD－0.013 3CD－0.227 3A2－0.047 3B2－0.057 8C2－0.157 3D2。方差分析结果见表6。

在实验设计范围内，一次项的偏回归系数的绝对值A明显大于B、C、D，说明提取溶剂对青牛胆块根中药根碱和盐酸巴马汀的提取量影响最大。

由表6可知，该模型（F＝79.29，P＜0.000 1）极为显著，表明响应回归模型差异有统计学意义；模型中失拟项（F＝2.60，P＝0.184 8＞0.05）不显著，表明差异无统计学意义，表明该模型设计合理。该模型复相关系数R2＝0.987 5，表明该回归模型拟合性好、回归方程代表性良好，实验结果与预测值一致性良好。模型校正系数＝0.975 1，表明青牛胆块根中药根碱和盐酸巴马汀提取量97.51%的实验结果分布在响应面方程中，仅有2.49%实验结果不能解释其响应值的变化。复相关系数和校正系数R2值均接近1，表明该模型能够有效预测响应面值；y的变异系数为2.65%，变异系数较小，表明该模型方法的精确度和可靠性相对较高。方差分析结果表明，方程中的A、B、D、AD、BD、A2、B2、C2、D2对青牛胆块根中药根碱和盐酸巴马汀提取量的影响差异有统计学意义，故可用此模型对提取工艺进行分析和预测。

表6 回归模型的方差分析结果Tab.6 Results of analysis of variance of regression model

2.10.2 因素间的交互影响 结果显示，交互项AD、BD有较高的显著性，表明提取溶剂、液料比和提取次数的交互作用对青牛胆块根中药根碱和盐酸巴马汀提取量有较显著影响。经Design Expert 11.0软件处理，得到了提取溶剂体积分数（A）、液料比（B）和提取次数（D）交互作用的响应面三维图和等高线图，见图2～图7。其中AD、BD在等高线图中呈椭圆形，说明2个因素间交互作用较强，对提取量的影响显著。

由图2～图7可知，溶剂体积分数与提取次数、液料比与提取次数的交互作用均显著，溶剂体积分数与液料比、溶剂体积分数与提取时间、液料比与提取时间、提取时间与提取次数的交互作用均不显著。由图4可知，响应曲面的坡度相对较为陡峭，表明青牛胆块根中药根碱和盐酸巴马汀的提取量对溶剂体积分数和提取次数的改变较为敏感。提取溶剂为体积分数为60%的乙醇，提取次数为2次，青牛胆块根中药根碱和盐酸巴马汀的提取量达到最大值。由图4可知，提取溶剂体积分数的变化对青牛胆块根中药根碱和盐酸巴马汀提取量的影响，相比提取次数变化对青牛胆块根中药根碱和盐酸巴马汀提取量的影响大。由图6可知，响应曲面的坡度相对较为陡峭，表明青牛胆块根中药根碱和盐酸巴马汀提取量对液料比和提取次数的改变较为敏感。

图2 溶剂体积分数与液料比交互作用对青牛胆块根中药根碱和盐酸巴马汀提取量的影响Fig.2 Effect of interaction between solvent concentration and liquid-material ratio on the extraction amount of jatrorrhizine and palmatine hydrochloride from Tinospora sagittata

图4 溶剂体积分数与提取次数交互作用对青牛胆块根中药根碱和盐酸巴马汀提取量的影响Fig.4 Effect of interaction between solvent concentration and extraction times on the extraction jatrorrhizine and palmatine hydrochloride from Tinospora sagittata

图7 提取时间与提取次数交互作用对青牛胆块根中药根碱和盐酸巴马汀提取量的影响Fig.7 Effect of interaction between extraction time and extraction times on the extraction amount of jatrorrhizine and palmatine hydrochloride from Tinospora sagittata

结果显示，液料比为16∶1，提取次数为2次，青牛胆块根中药根碱和盐酸巴马汀的提取量达到最大值。由图6可知，提取次数的变化对青牛胆块根中药根碱和盐酸巴马汀提取量的影响，相比于液料比变化对青牛胆块根中药根碱和盐酸巴马汀提取量的影响大。

图6 液料比与提取次数交互作用对青牛胆块根中药根碱和盐酸巴马汀提取量的影响Fig.6 Effect of interaction between liquid-material ratio and extraction times on the extraction amount of jatrorrhizine and palmatine hydrochloride from Tinospora sagittata

图3 溶剂体积分数与提取时间交互作用对青牛胆块根中药根碱和盐酸巴马汀提取量的影响Fig.3 Effect of interaction between solvent concentration and extraction time on the extraction amount of jatrorrhizine and palmatine hydrochloride from Tinospora sagittata

图5 液料比与提取时间交互作用对青牛胆块根中药根碱和盐酸巴马汀提取量的影响Fig.5 Effect of interaction between liquid-material ratio and extraction time on the extraction amount of jatrorrhizine and palmatine hydrochloride from Tinospora sagittata

2.10.3 最佳工艺验证 用Design Expert 11.0软件对数据进行分析，结果显示，以体积分数60%的乙醇为提取溶剂、液料比为16∶1、提取时间为40 min、连续提取2 次为青牛胆块根中药根碱和盐酸巴马汀的最佳提取条件。在此条件下进行3 次平行验证实验，青牛胆块根中药根碱和盐酸巴马汀的提取量分别为1.439、1.448、1.443 mg·g－1，与预测值（1.464 mg·g－1）几乎一致，表明用响应面分析法优化青牛胆块根中药根碱和盐酸巴马汀的提取工艺是可行的。

3 讨论

生物碱类成分是许多药用植物的重要有效成分，具有一定的生物活性。青牛胆块根富含生物碱、二萜类和黄酮类化合物［4］，其中小檗碱类生物碱巴马汀和药根碱是主要的成分，药理活性较好，具有抗幽门螺杆菌、抗癌、抗炎镇痛等作用［16-18］，故选择药根碱和巴马汀的提取量作为考察指标。将药根碱和盐酸巴马汀的对照品溶液分别在190～400 nm 紫外波长下扫描，结果显示，在225、265、345 nm 处均有吸收峰，但在345 nm 波长处的基线较225、265 nm 处平稳，这可能是由于部分官能团和共轭结构在225、265 nm附近有吸收，而在345 nm 附近无吸收［19］，故考虑将225、265 nm 作为检测波长。根据实际液相检测效果，发现以225 nm 作为检测波长，既可对目标成分进行准确分析，又可将相关物质有效检出，从而较为全面地反映样品的信息，故将225 nm 作为检测波长较为适宜。此外，本研究通过对流动相的考察，分别以水-甲醇、水-乙腈、3 m L·L－1磷酸溶液-甲醇、3 m L·L－1磷酸溶液-乙腈作为流动相进行梯度洗脱，发现以3 m L·L－1磷酸溶液-乙腈作为流动相时，色谱峰分离较好，拖尾现象较少，故以3 mL·L－1磷酸溶液-乙腈作为流动相。在选择色谱柱时，发现Agilent Extend-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）的分析效果较InertSustaun C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）好，故选用Agilent Extend-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）。

由于产区、采收季节、提取和检测方法不同，生物碱成分的类别和含量存在一定差异。陈旭冰等［20］研究发现，不同生长年限青牛胆块根中巴马汀和药根碱的含量有明显变化，在第一年时含量均较高，随着生长年限的增加，含量逐渐降低，生长到第四年时（块根长到3.0 g以上）含量达到最大值（巴马汀0.14%，药根碱0.10%），之后含量略有下降。也有文献报道［21］，用HPLC-ESI-MS／MS 同时 测定金果 榄 中5种成分含量，通过对产自广西的3 批金果榄进行测定，其中盐酸巴马汀（掌叶防己碱）、药根碱的含量分别在40.89～45.14、3.56～4.21 mg·g－1范围内，而本课题研究中盐酸巴马汀、药根碱的含量检测最大值分别为1.049、0.413 mg·g－1。本研究在初步考察青牛胆块根中药根碱和盐酸巴马汀的提取工艺时，比较了浸渍法、回流提取、超声提取对青牛胆中小檗碱类生物碱提取量的影响，结果显示，回流提取生物碱量相对较多，故本实验选择回流提取法进行操作。除此之外，提取溶剂、液料比、提取时间和提取次数均会影响提取效果。基于响应面法设计，以药根碱和巴马汀的提取量之和作为考察指标，在单因素考察的基础上，探究青牛胆块根中药根碱和盐酸巴马汀的最佳提取工艺，即提取溶剂为体积分数为60%的乙醇、液料比为16∶1、提取时间为40 min、提取次数为2次。按照最佳提取工艺进行验证，青牛胆块根中药根碱和盐酸巴马汀的实际测定值与预测值基本一致。