HPLC法同时测定益肾汤中7种成分的含量
2022-07-06赵群涛尚庆霞
程 伟，赵群涛，裘 罡，杜 瑞，尚庆霞
信阳市食品药品检验所，信阳 464000
中药汤剂是最常用的中药复方剂型，也是中药历史上应用最久和最广的制剂。从临床疗效来看，一般认为汤剂的疗效优于其他制剂［1］。益肾汤是信阳市圣康医院开发的常用方剂，疗效显著。本方由红花、肉苁蓉、当归、丹参、淫羊藿、补骨脂等十余味中药组成，具有益气养阴、活血助阳的功效，用于气阴两虚、阳痿血瘀阻滞所致的面色无华或晦暗、少气乏力、手足心热、口干咽燥、腰脊酸痛、溺少浮肿、肢冷体麻等慢性肾炎证候者的治疗。红花在方中起活血通经、散瘀止痛的功效，大量研究发现，红花主要含黄酮类、生物碱类、聚炔类等多种化学成分，红花黄色素为红花中的主要活性成分［2］。肉苁蓉素有“沙漠人参”之美誉，其化学成分及特有的结构是肉苁蓉发挥功效作用的物质基础，如苯乙醇苷类中的松果菊苷、毛蕊花糖苷及多糖是抗氧化抗衰老、缓解疲劳等生物活性的物质基础［3］。中高剂量的松果菊苷可以降低糖尿病肾病大鼠的血糖，抑制糖尿病肾病大鼠的肾间质纤维化和肾组织细胞凋亡，改善大鼠的肾功能［4］。研究表明，当归中的有效化学成分在抑制微炎症和慢性肾小球肾炎方面的效果明显［5］。丹参及其提取物均被证实有良好的抗炎效果，丹参水提物和醇提物均显示出良好的肾保护作用［6］。研究发现，淫羊藿苷可以改善肾脏组织学形态和功能，增加肾脏干、祖细胞数量和调节肾发育相关基因的表达，更能改善由氢化可的松诱导的大鼠肾阳不足证［7］。补骨脂中的呋喃香豆素类成分补骨脂素和异补骨脂素是其主要活性成分，在调节雌激素水平、抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗炎、抗抑郁、促进骨生长、保护神经等方面有多重活性［8］。本方法以方中6味药材所含的主要成分羟基红花黄色素A 等为指标成分，建立测定此药7种活性成分的高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC），为控制该制剂的质量提供依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器
1200型高效液相色谱仪（G1314B VWD 可变波长紫外检测器，安捷伦科技有限公司）；Mettler XS205型十万分之一电子分析天平、TGW16型台式高速离心机均购自长沙英泰仪器有限公司；德国普兰德移液枪（1、5 m L）购自保定普伦商贸有限公司。
1.2 试药
对照品：羟基红花黄色素A（批号111637-201308，质 量 分 数 为96.5%），松 果 菊 苷（批 号111670-201505，质量分数为92.5%），阿魏酸（批号110773-201614，质量分数为99.0%），丹酚酸B（批号111592-201716，质量分数为94.1%），淫羊藿苷（批号110737-201516，质量分数为94.2%），补骨脂素（批号110739-201617，质量分数为99.7%），异补骨脂素（批号110738-201715，质量分数为99.5%），均购自中国食品药品检定研究院；乙腈（色谱纯，美国天地公司）；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。
益肾汤由红花、肉苁蓉、当归、丹参、淫羊藿、补骨脂、补骨脂、地龙、鸡血藤、巴戟天、黄精、党参、金樱子、菟丝子组成，为本实验室自制。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色 谱 柱：Sunniest C18（250 mm×4.6 mm，5μm）。流动相：乙腈（A）-1 m L·L－1磷酸水溶液（B）。梯度洗脱（0～5 min，14%A；5～30 min，14%A～34%A；30～40 min，34%A；40～45 min，34%A～14%A；45～55 min，14%A）。检测波长：0～10 min为403 nm（检测羟基红花黄色素A），10～16 min为330 nm（检测松果菊苷），16～22 min为320 nm（检测阿魏酸），22～30 min为286 nm（检测丹酚酸B），30～34 min为270 nm（检测淫羊藿苷），34～50 min为246 nm（检测补骨脂素与异补骨脂素）。流速：1.0 m L·min－1。柱温：30℃；进样量：5μL。
2.2 溶液的制备
2.2.1 样品的制备 各味药装布袋加水浸泡30 min，置于煎药机中加热煎煮2次，第1次2 h，第2次1.5 h，合并煎液，静置，沉淀，过滤，将滤液减压浓缩至1 000 m L，加热至沸，灌封，即得。
2.2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取羟基红花黄色素A、松果菊苷、阿魏酸、丹酚酸B、淫羊藿苷、补骨脂素与异补骨脂素7种对照品适量，加甲醇制成质量 浓 度 分 别 为436.18、577.94、455.00、683.92、639.05、489.73、451.73μg·m L－1的对照品储备溶液，按照不同稀释倍数配制成5个不同质量浓度的混合对照品溶液。
2.2.3 供试品溶液的制备 精密量取样品1 m L，置于5 m L 具塞锥形瓶中，加甲醇至刻度，振摇后以15 000 r·min－1离心，上清液用0.45μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
2.2.4 阴性样品溶液的制备 按处方比例和制备工艺分别制备不含红花、不含肉苁蓉、不含当归、不含丹参、不含淫羊藿、不含补骨脂的阴性样品，再按照2.2.2项下方法分别制备阴性样品溶液。
2.3 专属性考察
取2.2项下混合对照品溶液、供试品溶液、6 种阴性样品溶液各5μL，按照2.1项下的色谱条件进样测定，记录色谱图。结果见图1。由图1 可知，供试品色谱图中在与对照品色谱图上相对应的位置有相同的色谱峰，且阴性样品无干扰。
图1 HPLC图Fig.1 HPLC chromatograms
2.4 线性关系考察
依次精密吸取2.2.1项下的系列混合对照品溶液5μL注入高效液相色谱仪，按照2.1 项下的色谱条件进样测定，记录峰面积。分别以各成分的质量浓度（μg·m L－1）为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y），进行线性回归，结果见表1。结果表明，7种成分在质量浓度范围内与其峰面积线性关系良好。
表1 回归方程与线性范围Tab.1 Regression equations and linear ranges
2.5 精密度实验
精密吸取2.2.1 项下的同一混合对照品溶液5 μL，连续进样6 次，按照2.1 项下色谱条件进行测定，记录峰面积。计算得羟基红花黄色素A、松果菊苷、阿魏酸、丹酚酸B、淫羊藿苷、补骨脂素和异补骨脂 素 峰 面 积 的RSD 值 分 别 为0.94%、0.72%、1.02%、0.51%、1.10%、0.45%、0.68% （n＝6），表明仪器的精密度良好。
2.6 稳定性实验
取同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h进样5μL，按照2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。计算得羟基红花黄色素A、松果菊苷、阿魏酸、丹酚酸B、淫羊藿苷、补骨脂素和异补骨脂素峰面积的RSD 值 分 别 为1.20%、0.98%、1.41%、1.52%、0.84%、1.05%、0.95%，表明在24 h内供试品溶液的稳定性良好。
2.7 重复性实验
取同一批益肾汤（批号20210318），平行精密量取6份，每份1 m L，按照2.2.2项下供试品溶液处理方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算羟基红花黄色素A、松果菊苷、阿魏酸、丹酚酸B、淫羊藿苷、补骨脂素和异补骨脂素的含量。计算得7种成分的含量平均值分别为35.7、234.5、45.2、138.1、50.6、49.1、45.0μg·mL－1，RSD值 分 别 为1.02%、1.13%、1.38%、0.85%、0.93%、0.62%、0.75% （n＝6），表明方法的重复性良好。
2.8 加样回收率实验
取已知含量的益肾汤（批号20210318）样品6份，每份精密量取0.5 m L，分别精密加入混合对照品溶液1 m L（羟基红花黄色素A、松果菊苷、阿魏酸、丹酚酸B、淫羊藿苷、补骨脂素和异补骨脂素的质量浓度 分 别 为17.45、115.59、22.75、68.39、25.56、24.49、22.59μg·m L－1），按照2.2.2项下供试品溶液处理方法制备加样供试品溶液，再按照2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算各成分的回收率。计算得羟基红花黄色素A、松果菊苷、阿魏酸、丹酚酸B、淫羊藿苷、补骨脂素和异补骨脂素的平均加样回收率分别为99.20%（RSD＝0.61%）、96.25%（RSD＝2.63%）、98.53%（RSD＝1.18%）、96.98%（RSD＝2.10%）、96.90%（RSD＝1.81%）、98.78%（RSD＝1.09%）、98.65%（RSD＝1.00%）（n＝6）。
2.9 样品的含量测定
取3批益肾汤，按照2.2.2项下供试品溶液处理方法制备供试品溶液，再按照2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，根据2.4项下得到的标准曲线方程计算各成分的含量。结果见表2。
表2 样品含量测定结果（n＝3）Tab.2 Results of content determination（n＝3）
3 讨论
中药汤剂是中医临床用药最古老、最常用的剂型。《汤液本草》中有记载“汤者，荡也，去大病用之”。在治疗新冠肺炎的处方中，最常用的肺炎1号、清肺排毒汤等经临床验证有一定疗效［9］，在新冠肺炎预防应用中，共检索到预防方102条，其中主要采用水煎剂（69种）或代茶饮（26种）口服方式［10］。益肾汤应用于慢性肾炎证候者有较好的疗效，前期曾用薄层色谱法对其个别成分进行定性鉴别，但由于中药制剂配方复杂、成分较多，仅进行薄层鉴别难以保证质量的均一性和可靠性，故本研究对其制剂中的7种有效成分进行测定。
本实验分别考察甲醇-1 m L·L－1磷酸溶液、乙腈-1 m L·L－1磷酸溶液和乙腈-水3种不同流动相系统，结果表明，以乙腈-1 m L·L－1磷酸溶液作为流动相时，各成分峰形较好，且分离效果良好，分析效率更高，更节约检测时间和成本。在选择检测波长参数方面，参考目标成分现有相关文献［11-20］，按不同时间段设置波长参数：0～10 min为403 nm（检测羟基红花黄色素A），10～16 min为330 nm（检测松果菊苷），16～22 min为320 nm（检测阿魏酸），22～30 min为286 nm（检测丹酚酸B），30～34 min为270 nm（检测淫羊藿苷），34～50 min为246 nm（检测补骨脂素与异补骨脂素），在此条件下各成分均有最大紫外吸收，以保证对各待测成分均能准确定量。本研究采用HPLC法快速测定该制剂中羟基红花黄色素A 等7种中药有效成分的含量，方法简便、可靠，重复性好，结果准确，可为益肾汤的质量控制提供参考。
