HPLC-QAMS法同时测定紫花烧伤软膏中10种有效成分的含量

张小折，叶晓娅，田广林

1.平顶山市食品药品检验所，平顶山 467000；2.遂成药业股份有限公司，郑州 451100

紫花烧伤软膏由紫草、地黄、熟地黄、花椒、黄连、当归、甘草和冰片8味中药材加工而成，具有清热凉血、化瘀解毒、止痛生肌的功效，主要用于Ⅰ、Ⅱ度以下烧伤、烫伤的治疗，还可用于压疮［1-2］的治疗，为《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版一部［3］收载品种，是临床上的常用药物，现行质量标准仅用气相色谱法对佐药冰片中龙脑的含量进行检测，未检索到与该制剂质量控制相关的文献，难以全面评价紫花烧伤软膏的整体质量。中药复方制剂由多味中药材配伍组方，同时每味中药材又含有多种药效成分，具有多靶点、共同奏效等特点，建立多指标成分定量控制模式对提升紫花烧伤软膏的整体质量具有重要意义。高效液相色谱-一测多评（high performance liquid chromatography-quantitative analysis of multi-components by single-marker，HPLCQAMS）法［4］利用中药药效组分间的内在函数关系，通过对1种质量稳定、易得、价廉的成分进行定量测定来实现对多种成分的同步检测，现在已越来越多地应用于中药［5-6］及其制剂［7-8］的研究中。本实验以乙酰紫草素为内参物，用HPLC-QAMS法对紫花烧伤软膏中10种成分的含量进行同步检测，首次建立了紫花烧伤软膏多指标成分质量评价方法，为全面、科学地评价该制剂的整体质量提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1260 Infinity型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Waters 2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Acclaim 120 C18液相色谱柱（赛默飞世尔科技公司）；Phenomenex Luna C18液相色谱柱（广州同谱实验仪器有限公司）；Waters XBridge C18液相色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm，美国Waters公司）；DL-720D 型超声波清洗器（上海之信仪器有限公司）；ME204型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 试药

对照品：毛蕊花糖苷（批号111530-201914，质量分数为95.2%）和β，β′-二甲基丙烯酰阿卡宁（批号111689-201805，质量分数为98.0%）均购自中国食品药品检定研究院；焦地黄苯乙醇苷B1（批号PRF7041822，质量分数为98.5%，成都普瑞法科技开 发 有 限 公 司）；羟 基-α-山 椒 素（批 号 RFSQ11402007006，质量分数为98.2%），羟基-β-山椒素（批号RFS-Q11502007016，质量分数为98.5%），羟基-γ-山椒素（批号RFS-Q11602011013，质量分数为98.3%），乙酰紫草素（批号RFS-Y18811804026，质量分数为98.5%），β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁（批号RFS-Y1510210028，质量分数为98.6%），异丁酰紫草素（批号RFS-Y18902102022，质量分数为98.0%），异戊酰紫草素（批号RFS-Y19002102026，质量分数为98.1%），均购自成都瑞芬思生物科技有限公司。乙腈为色谱纯；其余试剂为分析纯。

紫花烧伤软膏（规格：20 g·支－1；批号：20200302、20200501、20200607）购自山东润泽紫花药业有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

选 用 Acclaim 120 C18色 谱 柱（250 mm ×4.6 mm，5μm）。流动相：乙腈-1 m L·L－1磷酸。梯度洗脱：0～11 min，18.0%乙腈；11～20 min，18.0%→32.0%乙腈；20～32 min，32.0%→58.0%乙腈；32～57 min，58.0%→70.0%乙腈；57～70 min，70.0%→18.0%乙腈）。流速：0.9 m L·min－1。检测波长：330 nm（0～20 min检测毛蕊花糖苷和焦地黄苯乙醇苷B1）［9-12］和275 nm（20～70 min羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、羟基-γ-山椒素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁、异丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡宁和异戊酰紫草素）［13-20］。柱温：30℃。进样量：10μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 精密称取毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1、羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、羟基-γ-山椒素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁、异丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡宁和异戊酰紫草素对照品适量，用体积分数50%的甲醇制成 质 量 浓 度 依 次 为0.714、0.298、0.576、0.252、0.136、0.982、0.510、0.478、0.634 和1.530 g·L－1的混合对照品储备液。精密吸取储备液1.0 m L，用体积分数50%的甲醇稀释20倍得混合对照品溶液（10 种 成 分 的 质 量 浓 度 分 别 为35.7、14.9、28.8、12.6、6.8、49.1、25.5、23.9、31.7、76.5 mg·L－1）。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称定紫花烧伤软膏2.0 g，精密加入体积分数50%的甲醇25 m L，称质量，超声10 min，放冷，补足减失的质量，摇匀，即得。取按照紫花烧伤软膏质量标准［3］分别制备缺紫草、缺花椒、缺地黄和熟地黄的3个阴性供试品各适量，再按上述方法制得3个阴性供试品溶液。

2.3 系统适用性考察

按照2.1项下色谱条件，取混合对照品溶液和供试品溶液各10μL进样检测，记录色谱图。结果见图1。紫花烧伤软膏供试品溶液中毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1、羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、羟基-γ-山椒素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁、异丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡宁和异戊酰紫草素与相邻色谱峰的分离度＞1.5，理论板数按所测成分色谱峰计均不低于5 000。阴性供试品对紫花烧伤软膏中10种成分的同时测定无干扰。

图1 HPLC图Fig.1 HPLC chromatograms

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 精密吸取2.2.1项下储备液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 m L，用体积分数50%的甲醇分别定容至20 m L，得到编号分别为Ⅰ～Ⅵ的混合对照品溶液，按照2.1项下色谱条件进样检测，并记录色谱峰的峰面积，以10种成分的峰面积为纵坐标（y）、质量浓度为横坐标（x）进行线性回归，结果见表1。结果显示，在各自质量浓度范围内10 种成分的线性关系良好。

表1 10种成分线性关系测定结果Tab.1 Results of linear-regression analysis of the 10 constituents

2.4.2 精密度、重复性与稳定性实验 取同一份紫花烧伤软膏供试品溶液，按照2.1项下色谱条件，重复进样6次，每次10μL，记录色谱峰的峰面积。计算得10 种成分峰面积的RSD 值依次为1.06%、1.20%、1.13%、1.27%、1.38%、0.69%、1.08%、1.14%、0.99%、0.52%，表明在上述色谱条件下仪器的精密度良好。

取同一批紫花烧伤软膏，按照2.2.2项下方法制备6份供试品溶液，各精密吸取10μL，按照2.1项下色谱条件进样检测，用外标法计算含量。计算得10种成分含量的RSD 值分别为1.57%、1.71%、1.63%、1.86%、1.92%、1.05%、1.60%、1.58%、1.43%、0.88%，表明建立的方法具有良好的重复性。

分别于0、2、5、9、16、24 h各精密吸取同一份紫花烧伤软膏供试品溶液10μL，按照2.1项下色谱条件进样检测，记录色谱峰的峰面积。计算得10种成分峰面积的RSD 值依次为1.02%、1.15%、1.19%、1.30%、1.42%、0.66%、1.05%、1.18%、1.02%、0.57%，表明紫花烧伤软膏供试品溶液在24 h稳定性良好。

2.4.3 加样回收率实验 取已知10种成分含量的同一批紫花烧伤软膏，每份精密称定1.0 g，称取9份并随机均分成3 组，精密加入混合对照品溶液（毛蕊花糖苷质量浓度为0.607 g·L－1、焦地黄苯乙醇苷B1质量浓度为0.243 g·L－1、羟基-α-山椒素质量浓度为0.452 g·L－1、羟基-β-山椒素质量浓度 为0.169 g·L－1、羟 基-γ-山 椒 素 质 量 浓 度 为0.096 g·L－1、乙酰紫草素质量浓度为0.817 g·L－1、β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁质量浓度为0.379 g·L－1、异丁酰紫草素质量浓度为0.341 g·L－1、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡宁质量浓度为0.524 g·L－1、异戊酰紫草 素 质 量 浓 度 为1.197 g·L－1）0.8、1.0 和1.2 m L各1组，再按照2.2.2 项下方法制成加样供试品溶液，按照2.1项下色谱条件检测并记录色谱峰的峰面积。计算得10 种成分的平均加样回收率（RSD 值）分 别 为99.46% （0.73%）、98.27%（1.16%）、97.84% （1.01%）、96.95% （1.45%）、97.18% （1.51%）、100.12% （0.66%）、99.27%（0.92%）、98.56% （1.08%）、99.15% （0.85%）、100.04%（0.78%）。

2.5 相对校正因子的测定及其耐用性考察

2.5.1 相对校正因子的测定 以乙酰紫草素为内参物，按照2.1项下色谱条件进样检测2.4.1项下编号为Ⅰ～Ⅵ的混合对照品溶液，记录色谱峰峰面积，计算其他9种成分的相对校正因子（relative correlation factor，RCF）。RCFk／s＝（Ak／Wk）／（As／Ws）＝（Ak×Ws）／（As×Wk），其中W和A分别表示质量浓度和峰面积，k和s分别表示内参物和其他待测成分。结果见表2。

表2 紫花烧伤软膏中各成分的RCFTab.2 RCFs of various components in Zihua Burn Ointment

2.5.2 RCF耐用性考察

2.5.2.1 仪器与色谱柱 选用不同品牌高效液相色谱仪（Agilent 1260 Infinity型、Waters 2695型）和不同品牌液相色谱柱（Acclaim 120 C18柱、Phenomenex Luna C18柱和Waters XBridge C18柱），考察该条件对各成分RCF 值的影响，按照2.1项下色谱条件进样检测2.1.1项下混合对照品溶液，记录色谱峰的峰面积，计算各成分的RCF 值，结果见表3。结果显示，各成分RCF 的RSD 值在0.83%～1.91%范围内，表明仪器及色谱柱对RCF无显著影响。

表3 不同仪器及色谱柱条件下的RCFTab.3 RCFs detected with different instruments and under different chromatographic column conditions

2.5.2.2 流 速 在 流 速0.7、0.8、0.9、1.0、1.1 m L·min－1条件下，精密吸取2.1.1项下混合对照品溶液，按照2.1项下色谱条件检测并记录色谱峰的峰面积，计算各成分的RCF 值，结果见表4。结果显示，各成分RCF 的RSD 值在1.01%～1.91%范围内，表明流速对RCF无显著影响。

表4 不同流速条件下的RCFTab.4 RCFs detected under different flow rates

2.5.2.3 柱温 在柱温20、22、25、28、30℃条件下，精密吸取2.1.1项下混合对照品溶液，按照2.1项下色谱条件检测并记录色谱峰的峰面积，计算各成分的RCF值，结果见表5。结果显示，各成分RCF的RSD值在0.97%～1.94%范围内，表明柱温对RCF 无显著影响。

表5 不同柱温条件下的RCFTab.5 RCFs detected at different column temperatures

2.5.3 色谱峰定位 分别选用不同品牌的高效液相色谱仪（Agilent 1260 Infinity型、Waters 2695型）和不同品牌的液相色谱柱（Acclaim 120 C18柱、Phenomenex Luna C18柱和Waters XBridge C18柱），按照2.1项下色谱条件进样检测2.1.1项混合对照品溶液，记录保留时间，采用相对保留时间（relative retention time，RRT）值法对待测成分色谱峰进行定位，结果见表6。结果显示，毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1、羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、羟基-γ-山椒素、β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁、异丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡宁、异戊酰紫草素和乙酰紫草素RRT 的RSD 值在0.78%～1.78%范围内，表明采用RRT 值法可以对目标化合物色谱峰进行准确定位。

表6 仪器及色谱柱对RRT的影响Tab.6 Effects of instruments and chromatographic columns on RRT

2.6 含量测定

为验证建立的HPLC-QAMS 法的准确性及可行性，取紫花烧伤软膏，依法制备供试品溶液并进样检测，分别以HPLC-QAMS法和外标法计算各成分的含量，对比2 种方法检测结果的差异。结果见表7。

由表7可知，ESM 和HPLC-QAMS法测得的结果无显著差异，表明HPLC-QAMS法可以用于检测紫花烧伤软膏中10种成分的含量。

表7 紫花烧伤软膏中10种成分含量的测定结果（n＝3）Tab.7 Determination results of 10 components in Zihua Burn Ointment（n＝3）

3 讨论

3.1 指标性成分的选择

紫花烧伤软膏由紫草、黄连、地黄、熟地黄、当归、花椒、冰片和甘草加工而成，处方中紫草具有凉血活血、生肌止痛的功效，黄连具有清热燥湿的功效，二者合为君药；生地能够清热凉血、泻火滋阴，熟地能够填精补髓，与养血活血的当归共为臣药；佐药包括能够生肌止痛、泻火的冰片与能够温通经络、止痛止痒的花椒；使药甘草调和诸药、缓急止痛。诸药合用，清热凉血、化瘀生肌。为客观评价紫花烧伤软膏的内在整体质量，本实验以君药紫草的主要活性成分乙酰紫草素、β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁、异丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡宁和异戊酰紫草素，臣药生地、熟地的主要代表性成分毛蕊花糖苷和焦地黄苯乙醇苷B1，以及佐药花椒的主要成分羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素和羟基-γ-山椒素为分析指标，采用HPLCQAMS法测定其含量。

3.2 供试品溶液制备方法的确定

本实验在确定供试品溶液制备方法时，考察了以体积分数25%甲醇［10-11］、体积分数50%甲醇［9］、甲醇［12-14］、体积分数50%乙醇［16］、石油醚［17-18］为提取溶剂，以超声和加热回流方法时10种成分的提取率，结果显示，用体积分数50%甲醇超声提取时，10种待测成分的响应值较大。继而以体积分数50%甲醇为溶剂，考察了提取时间5、10、15、20、40 min对10种成分的含量及杂质含量的影响，结果显示，提取10 min时，已基本提取完全，故选取体积分数50%甲醇提取10 min为供试品溶液的制备方法。

3.3 流动相的优化筛选

本实验在优化筛选流动相时，分别以乙腈-1 m L·L－1磷酸溶液［9］、乙腈-2 m L·L－1磷酸溶液［12］、乙腈-水［10-11］、甲 醇-水［13］、乙 腈-1 m L·L－1甲 酸 溶液［20］为流动相，按照2.1项下色谱条件进样检测供试品溶液，对不同流动相条件下的HPLC 图进行分析比对，发现将乙腈-1 m L·L－1磷酸溶液作为流动相时，基线平稳，峰形较好，各成分响应值大，进而又摸索了有机相与水相的比例，最终确定以2.1项下的色谱条件检测紫花烧伤软膏中10种成分的含量。

本实验以乙酰紫草素作为内参物，用HPLCQAMS法对紫花烧伤软膏中毛蕊花糖苷、焦地黄苯乙醇苷B1、羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、羟基-γ-山椒素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁、异丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡宁和异戊酰紫草素含量进行了检测分析，考察了RCF 的耐用性，将ESM法与HPLC-QAMS法测定结果进行了对比，结果显示在该色谱条件下RCF具有较好的耐用性，用ESM法与HPLC-QAMS法获得的结果间差异无统计学意义，对全面评价紫花烧伤软膏的质量具有重要意义。