皮肤病血毒丸的HPLC指纹图谱研究

林忠泽，张清民，盛钊君，邓煜然，袁洁丽，林 芳

1.特一药业集团股份有限公司，江门 529200；2.广东江门中医药职业学院，江门 529000；3.五邑大学，江门 529000

皮肤病血毒丸为民国时期京城四大名医施今墨所创，由茜草、黄柏、金银花、当归、川芎、大黄、连翘、牡丹皮等多味中药组成，具有清热解毒、消肿止痒的功效。皮肤病血毒丸在临床应用上可针对皮肤病的病因，从清热解毒、消肿止痒、调节机体功能3个方面入手，通过清除体内毒素达到外病内治的目的，因此可用于多种皮肤科疾病的治疗，而用于治疗痤疮的疗效尤为显著［1-4］。现行皮肤病血毒丸的国家药品标准［5］仅有薄层色谱的鉴别实验，缺乏对其内在质量的控制手段，目前也只有2篇关于测定皮肤病血毒丸中大黄素与大黄酚含量的文献［6-7］。中药指纹图谱是一种综合地反映中药多成分特征的质量控制模式，可用于比较不同样品之间的成分相似性，是目前中药整体质量评价的重要手段［8-10］。为能够评价和控制皮肤病血毒丸的质量，本研究参考中药指纹图谱相关文献［11-21］，用高效液相色谱法（high-performance liquid chromatography，HPLC）建立皮肤病血毒丸的指纹图谱，为对其内在质量进行有效控制提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Ulti Mate3000型高效液相色谱仪（包括Chromatpgraphy Data System 7.2 色 谱 工 作 站）、Evolution 201紫外可见光分光光度计均购自赛默飞世尔科技有限公司；KQ-500DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；ML204T 电子天平（万分之一，梅特勒-托利多仪器上海有限公司）。

1.2 试药

皮肤病血毒丸14批（特一药业集团股份有限公司，批 号 分 别 为35200601、35200602、35200603、35201101、35201201、35210101、35210102、35210201、35210202、35210203、35210301、35210302、35210303、35210304，编号分别为S1～S14）。

对照品：没食子酸（批号110831-201204）、绿原酸（批号110753-201817）、阿魏酸（批号110773-201614）、丹皮酚（批号110708-201908）、大黄酸（批号110757-201607）、大黄酚（批号110796-201621）、大黄素甲醚（批号110758-201415）、大叶茜草素（批号110884-201606）均购自中国食品药品检定研究院。

对照药材：金银花（批号121060-201608）、茜草（批号121049-201705）、大黄（批号120984-201202）、川芎（批号120918-201813）、当归（批号120927-201617）、连翘（批号120908-201817）、牡丹皮（批号121490-201603）、黄柏（批号121510-201807）均购自中国食品药品检定研究院。

乙腈（色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司）；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

AcclaimTM120 C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5μm）。流动相：乙腈（A）-1 m L·L－1磷酸溶液（B）。梯度洗脱：0～8.5 min，3%A～8%A；8.5～13 min，8%A～15%A；13～30 min，15%A～26%A；30～31 min，26%A～29%A；31～40 min，29%A～48%A；40～50 min，48%A ～80%A；50～55 min，80%A～95%A；55～60 min，95%A～100%A。流速：1.0 m L·min－1。柱温：25℃。检测波长：280 nm。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取没食子酸、绿原酸、阿魏酸、丹皮酚、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、大叶茜草素对照品适量，用甲醇配制成每1 m L含没 食 子 酸41.4 μg、绿 原 酸0.413 mg、阿 魏 酸28.1μg、丹皮酚20.0μg、大黄酸54.2μg、大黄酚55.6μg、大黄素甲醚26.0μg、大叶茜草素0.104 4 mg的各单一对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取皮肤病血毒丸适量，除去包衣，研细，取约1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入体积分数70%的甲醇25 m L，密塞，称定质量，超声处理（功率500 W，频率40 k Hz）30 min，放冷，再称定质量，用体积分数70%的甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.2.3 对照药材溶液的制备 分别取金银花、茜草、大黄、川芎、当归、连翘、牡丹皮、黄柏对照药材适量，分别按2.2.2项下方法制备成各对照药材溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度实验 精密吸取同一供试品溶液10μL，按照2.1项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。以3号共有峰（绿原酸）为参照峰（S峰），计算得各共有峰相对保留时间的RSD 值为0.05%～0.81%，相对峰面积的RSD 值为0.19%～1.89%，表明仪器的精密度良好。

2.3.2 重复性实验 取同一样品，按照2.2.2项下方法平行制备6份供试品溶液，按照2.1项下色谱条件测定。计算得各共有峰相对保留时间的RSD 值为0.02%～0.74%，相对峰面积的RSD 值为0.19%～1.89%，表明仪器的精密度良好且该方法的重复性良好。

2.3.3 稳定性实验 取同一供试品溶液，按照2.1项下色谱条件下于0、2、4、6、8、12、24 h进样测定，计算得各共有峰相对保留时间的RSD 值为0.04%～0.52%，相对峰面积的RSD 值为0.30%～2.86%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4 指纹图谱相似度评价

2.4.1 指纹图谱的建立 取14批皮肤病血毒丸，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进行测定，结果见图1。将色谱图数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004 A 版）”软件进行分析，对各指纹图谱峰进行自动匹配和多点校正，拟合得到皮肤病血毒丸的标准对照图谱，结果见图2。

图1 14批（S1～S14）皮肤病血毒丸的指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprints of 14 batches（S1～S14）of Pifubing Xuedu Pills

图2 皮肤病血毒丸的HPLC指纹图谱Fig.2 HPLC fingerprint of Pifubing Xuedu Pills

对样品进行相似度分析，14批样品的相似度在0.987～0.999范围内，结果见表1。同时确定20个共有峰，其中3号峰（绿原酸）峰形对称、分离度好、峰面积大，因此选其作为参照峰（S峰），以计算相对保留时间和相对峰面积，结果见表2、表3。

表1 相似度评价结果Tab.1 Results of similarity evaluation

表2 共有峰相对保留时间Tab.2 Relative retention time of common peaks

表3 共有峰相对峰面积Tab.3 Relative peak area of common peaks

2.4.2 共有峰的指认和药材归属 分别吸取皮肤病血毒丸供试品溶液、各对照药材溶液和对照品溶液，按照2.1项下色谱条件测定，记录色谱图，结果见图3、图4。

图3 皮肤病血毒丸与对照药材溶液的HPLC图Fig.3 HPLC fingerprints of Pifubing Xuedu Pills and their control medicinal herbs solution

图4 皮肤病血毒丸与对照品溶液的HPLC图Fig.4 HPLC fingerprints of Pifubing Xuedu Pills and their reference substances solution

根据图谱各峰保留时间的比对分析，对供试品溶液中的相应色谱峰进行归属指认，其中1号峰为没食子酸、3号峰为绿原酸、6号峰为阿魏酸、15号峰为牡丹酚、17号峰为大黄素、18号峰为大黄酚、19号峰为大黄素甲醚、20号峰为大叶茜草素；5、6、16号峰归属连翘，3、6、9、10号峰归属川芎，1、8、15号峰归属牡丹皮，1、3、17、18、19号峰归属大黄，4号峰归属黄柏，20号峰归属茜草，6、10号峰归属当归，3、9、10号峰归属金银花。

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

本研究考察了乙腈-1 m L·L－1磷酸溶液、乙腈-1 m L·L－1冰醋酸溶液和乙腈-0.5 m L·L－1三氟乙酸溶液等流动相系统，结果发现用乙腈-1 m L·L－1磷酸溶液作为流动相进行梯度洗脱时，色谱峰基线平稳、峰形较好，故选择乙腈-1 m L·L－1磷酸溶液为流动相系统。在选定的流动相系统条件下，对254、280、330 nm 等波长进行筛选，发现在280 nm 处吸收最强，在该检测波长处，皮肤病血毒丸供试品溶液的色谱峰基线平稳，信息响应度强，数量较多，分离效果好，确定280 nm 为指纹图谱的最佳检测波长。

3.2 供试品溶液制备方法的选择

本实验考察了以体积分数50%的甲醇、体积分数为70%的甲醇和甲醇为提取溶剂，分别采用超声和加热回流方法提取，并考察了不同提取时间（超声提取15、30、45 min，回流提取30、45、60 min）对结果的影响。结果显示，将体积分数为70%的甲醇作为提取溶剂、超声提取30 min获得的色谱峰峰形较好而且响应值较好，故最终选择以体积分数为70%的甲醇作为提取溶剂、超声30 min作为供试品制备方法。

3.3 小结

皮肤病血毒丸制备工艺为组方中药饮片粉碎至细粉泛丸而成，组方中的茜草、黄柏、金银花、当归、川芎、大黄、连翘、牡丹皮是发挥清热解毒、消肿止痒、活血通络、泻火通便药效的主要成分，能荡涤脏腑热邪、发汗去邪、通便排毒、调整机体功能，达到恢复皮肤健康的目的，因此选用这8味药材作为研究皮肤病血毒丸的主要对象。本研究建立皮肤病血毒丸HPLC 指纹图谱，标定20个共有峰，并进行共有峰的归属，指认8种主要特征成分，用“中药色谱指纹图谱相似度评价软件（2004A 版）”对14批皮肤病血毒丸的指纹图谱进行相似度评价，相似度在0.987～0.999范围内，相对保留时间的RSD 值在0.04～0.62范围内，表明不同批次的皮肤病血毒丸化学成分大致相同，其生产质量较为稳定。

综上所述，该方法操作简单快捷，稳定性好，能够较好地反映皮肤病血毒丸的化学成分，用该方法评价皮肤病血毒丸的质量，可以弥补现行质量标准的不足和完善相关评价系统，为有效评价和控制皮肤病血毒丸的质量提供参考。