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皮肤病血毒丸的HPLC指纹图谱研究

2022-07-06林忠泽张清民盛钊君邓煜然袁洁丽

西北药学杂志 2022年4期
关键词:皮肤病批号供试

林忠泽,张清民,盛钊君,邓煜然,袁洁丽,林 芳

1.特一药业集团股份有限公司,江门 529200;2.广东江门中医药职业学院,江门 529000;3.五邑大学,江门 529000

皮肤病血毒丸为民国时期京城四大名医施今墨所创,由茜草、黄柏、金银花、当归、川芎、大黄、连翘、牡丹皮等多味中药组成,具有清热解毒、消肿止痒的功效。皮肤病血毒丸在临床应用上可针对皮肤病的病因,从清热解毒、消肿止痒、调节机体功能3个方面入手,通过清除体内毒素达到外病内治的目的,因此可用于多种皮肤科疾病的治疗,而用于治疗痤疮的疗效尤为显著[1-4]。现行皮肤病血毒丸的国家药品标准[5]仅有薄层色谱的鉴别实验,缺乏对其内在质量的控制手段,目前也只有2篇关于测定皮肤病血毒丸中大黄素与大黄酚含量的文献[6-7]。中药指纹图谱是一种综合地反映中药多成分特征的质量控制模式,可用于比较不同样品之间的成分相似性,是目前中药整体质量评价的重要手段[8-10]。为能够评价和控制皮肤病血毒丸的质量,本研究参考中药指纹图谱相关文献[11-21],用高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography,HPLC)建立皮肤病血毒丸的指纹图谱,为对其内在质量进行有效控制提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Ulti Mate3000型高效液相色谱仪(包括Chromatpgraphy Data System 7.2 色 谱 工 作 站)、Evolution 201紫外可见光分光光度计均购自赛默飞世尔科技有限公司;KQ-500DE 型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);ML204T 电子天平(万分之一,梅特勒-托利多仪器上海有限公司)。

1.2 试药

皮肤病血毒丸14批(特一药业集团股份有限公司,批 号 分 别 为35200601、35200602、35200603、35201101、35201201、35210101、35210102、35210201、35210202、35210203、35210301、35210302、35210303、35210304,编号分别为S1~S14)。

对照品:没食子酸(批号110831-201204)、绿原酸(批号110753-201817)、阿魏酸(批号110773-201614)、丹皮酚(批号110708-201908)、大黄酸(批号110757-201607)、大黄酚(批号110796-201621)、大黄素甲醚(批号110758-201415)、大叶茜草素(批号110884-201606)均购自中国食品药品检定研究院。

对照药材:金银花(批号121060-201608)、茜草(批号121049-201705)、大黄(批号120984-201202)、川芎(批号120918-201813)、当归(批号120927-201617)、连翘(批号120908-201817)、牡丹皮(批号121490-201603)、黄柏(批号121510-201807)均购自中国食品药品检定研究院。

乙腈(色谱纯,赛默飞世尔科技有限公司);水为超纯水;其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

AcclaimTM120 C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5μm)。流动相:乙腈(A)-1 m L·L-1磷酸溶液(B)。梯度洗脱:0~8.5 min,3%A~8%A;8.5~13 min,8%A~15%A;13~30 min,15%A~26%A;30~31 min,26%A~29%A;31~40 min,29%A~48%A;40~50 min,48%A ~80%A;50~55 min,80%A~95%A;55~60 min,95%A~100%A。流速:1.0 m L·min-1。柱温:25℃。检测波长:280 nm。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取没食子酸、绿原酸、阿魏酸、丹皮酚、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、大叶茜草素对照品适量,用甲醇配制成每1 m L含没 食 子 酸41.4 μg、绿 原 酸0.413 mg、阿 魏 酸28.1μg、丹皮酚20.0μg、大黄酸54.2μg、大黄酚55.6μg、大黄素甲醚26.0μg、大叶茜草素0.104 4 mg的各单一对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取皮肤病血毒丸适量,除去包衣,研细,取约1 g,精密称定,置于具塞锥形瓶中,精密加入体积分数70%的甲醇25 m L,密塞,称定质量,超声处理(功率500 W,频率40 k Hz)30 min,放冷,再称定质量,用体积分数70%的甲醇补足减失的质量,摇匀,过滤,取续滤液,即得。

2.2.3 对照药材溶液的制备 分别取金银花、茜草、大黄、川芎、当归、连翘、牡丹皮、黄柏对照药材适量,分别按2.2.2项下方法制备成各对照药材溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度实验 精密吸取同一供试品溶液10μL,按照2.1项下色谱条件连续进样6次,记录色谱图。以3号共有峰(绿原酸)为参照峰(S峰),计算得各共有峰相对保留时间的RSD 值为0.05%~0.81%,相对峰面积的RSD 值为0.19%~1.89%,表明仪器的精密度良好。

2.3.2 重复性实验 取同一样品,按照2.2.2项下方法平行制备6份供试品溶液,按照2.1项下色谱条件测定。计算得各共有峰相对保留时间的RSD 值为0.02%~0.74%,相对峰面积的RSD 值为0.19%~1.89%,表明仪器的精密度良好且该方法的重复性良好。

2.3.3 稳定性实验 取同一供试品溶液,按照2.1项下色谱条件下于0、2、4、6、8、12、24 h进样测定,计算得各共有峰相对保留时间的RSD 值为0.04%~0.52%,相对峰面积的RSD 值为0.30%~2.86%,表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4 指纹图谱相似度评价

2.4.1 指纹图谱的建立 取14批皮肤病血毒丸,按照2.2.2项下方法制备供试品溶液,按照2.1项下色谱条件进行测定,结果见图1。将色谱图数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004 A 版)”软件进行分析,对各指纹图谱峰进行自动匹配和多点校正,拟合得到皮肤病血毒丸的标准对照图谱,结果见图2。

图1 14批(S1~S14)皮肤病血毒丸的指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprints of 14 batches(S1~S14)of Pifubing Xuedu Pills

图2 皮肤病血毒丸的HPLC指纹图谱Fig.2 HPLC fingerprint of Pifubing Xuedu Pills

对样品进行相似度分析,14批样品的相似度在0.987~0.999范围内,结果见表1。同时确定20个共有峰,其中3号峰(绿原酸)峰形对称、分离度好、峰面积大,因此选其作为参照峰(S峰),以计算相对保留时间和相对峰面积,结果见表2、表3。

表1 相似度评价结果Tab.1 Results of similarity evaluation

表2 共有峰相对保留时间Tab.2 Relative retention time of common peaks

表3 共有峰相对峰面积Tab.3 Relative peak area of common peaks

2.4.2 共有峰的指认和药材归属 分别吸取皮肤病血毒丸供试品溶液、各对照药材溶液和对照品溶液,按照2.1项下色谱条件测定,记录色谱图,结果见图3、图4。

图3 皮肤病血毒丸与对照药材溶液的HPLC图Fig.3 HPLC fingerprints of Pifubing Xuedu Pills and their control medicinal herbs solution

图4 皮肤病血毒丸与对照品溶液的HPLC图Fig.4 HPLC fingerprints of Pifubing Xuedu Pills and their reference substances solution

根据图谱各峰保留时间的比对分析,对供试品溶液中的相应色谱峰进行归属指认,其中1号峰为没食子酸、3号峰为绿原酸、6号峰为阿魏酸、15号峰为牡丹酚、17号峰为大黄素、18号峰为大黄酚、19号峰为大黄素甲醚、20号峰为大叶茜草素;5、6、16号峰归属连翘,3、6、9、10号峰归属川芎,1、8、15号峰归属牡丹皮,1、3、17、18、19号峰归属大黄,4号峰归属黄柏,20号峰归属茜草,6、10号峰归属当归,3、9、10号峰归属金银花。

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

本研究考察了乙腈-1 m L·L-1磷酸溶液、乙腈-1 m L·L-1冰醋酸溶液和乙腈-0.5 m L·L-1三氟乙酸溶液等流动相系统,结果发现用乙腈-1 m L·L-1磷酸溶液作为流动相进行梯度洗脱时,色谱峰基线平稳、峰形较好,故选择乙腈-1 m L·L-1磷酸溶液为流动相系统。在选定的流动相系统条件下,对254、280、330 nm 等波长进行筛选,发现在280 nm 处吸收最强,在该检测波长处,皮肤病血毒丸供试品溶液的色谱峰基线平稳,信息响应度强,数量较多,分离效果好,确定280 nm 为指纹图谱的最佳检测波长。

3.2 供试品溶液制备方法的选择

本实验考察了以体积分数50%的甲醇、体积分数为70%的甲醇和甲醇为提取溶剂,分别采用超声和加热回流方法提取,并考察了不同提取时间(超声提取15、30、45 min,回流提取30、45、60 min)对结果的影响。结果显示,将体积分数为70%的甲醇作为提取溶剂、超声提取30 min获得的色谱峰峰形较好而且响应值较好,故最终选择以体积分数为70%的甲醇作为提取溶剂、超声30 min作为供试品制备方法。

3.3 小结

皮肤病血毒丸制备工艺为组方中药饮片粉碎至细粉泛丸而成,组方中的茜草、黄柏、金银花、当归、川芎、大黄、连翘、牡丹皮是发挥清热解毒、消肿止痒、活血通络、泻火通便药效的主要成分,能荡涤脏腑热邪、发汗去邪、通便排毒、调整机体功能,达到恢复皮肤健康的目的,因此选用这8味药材作为研究皮肤病血毒丸的主要对象。本研究建立皮肤病血毒丸HPLC 指纹图谱,标定20个共有峰,并进行共有峰的归属,指认8种主要特征成分,用“中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2004A 版)”对14批皮肤病血毒丸的指纹图谱进行相似度评价,相似度在0.987~0.999范围内,相对保留时间的RSD 值在0.04~0.62范围内,表明不同批次的皮肤病血毒丸化学成分大致相同,其生产质量较为稳定。

综上所述,该方法操作简单快捷,稳定性好,能够较好地反映皮肤病血毒丸的化学成分,用该方法评价皮肤病血毒丸的质量,可以弥补现行质量标准的不足和完善相关评价系统,为有效评价和控制皮肤病血毒丸的质量提供参考。

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