普通菜豆种质资源苗期抗旱性综合评价

李 洁 张小宁 晋凡生 韩彦龙 李海金

(山西农业大学 山西有机旱作农业研究院/有机旱作山西省重点实验室, 山西 太原 030000)

普通菜豆(PhaseolusvulgarisL.)又称芸豆，属豆科(Leguminosae)菜豆属(Phaseolus)，是我国主要杂粮作物之一，其籽粒营养丰富，具有药用价值，既是传统食粮，又是现代重要的保健品，颇受人们青睐，市场发展前景广阔，出口潜力巨大[1-2]。普通菜豆具有生长周期短，适应范围广，耐旱耐瘠、易于种植管理等优点，主要分布在北方和西南高寒冷凉地区。这些地区大多自然降雨量小，基础设施差，无灌溉条件，导致干旱成为普通菜豆生产的主要限制因子。因此，研究建立普通菜豆苗期抗旱性鉴定方法，用以筛选、发掘抗旱种质资源，对普通菜豆的抗旱性遗传改良、抗旱品种的选育具有重要意义。

国内外学者在各种作物的各个生育时期，针对作物抗旱性鉴定及抗旱指标筛选，开展了大量研究[3-6]。在普通菜豆方面，李龙等[7]利用灰色关联度理论进行苗期的抗旱性指标筛选，通过加权抗旱指数和抗旱度量值进行抗旱性综合评价，并通过聚类分析将50份普通菜豆参试材料分为高抗、中抗、敏感和高敏感4个等级；畅建武[8]采用蔗糖高渗溶液对615份菜豆资源进行鉴定，筛选出14份高度抗旱资源；曾辉等[9]通过隶属函数法和灰色关联分析法对30份普通菜豆进行抗旱姓综合评价，鉴定出F1863、F2973、F3992和F3057 4个抗旱性较强的菜豆品种；Rao等[10]通过籽粒收获指数筛选出SER16、SER5和SEA5这3种抗旱材料。目前，大量研究都是对作物某一时期的指标进行筛选，然后用隶属函数值或抗旱度量值进行综合评价，这种方法比以前仅用某一指标评价作物抗旱性，在可靠性上有了很大的提高，但是作物各个时期的抗旱性鉴定的结果差异仍然较大[11-13]。因此，研究普通菜豆某一时期新的抗旱性评价方法，有利于提高对普通菜豆抗旱种质资源鉴定的准确性。鉴于此，本研究选取50份普通菜豆材料，在苗期时测定干旱胁迫及复水后菜豆的各项生长及生理指标，并将干旱胁迫下的各项指标和复水后的各项指标分别进行综合评价，将两者综合评价的结果进行比较，以期为更准确地筛选和鉴定出抗旱能力强的种质资源，为普通菜豆抗旱种质资源鉴定提供方法及理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用不同抗旱性的普通菜豆材料共50份，所有种子均由山西省农业科学院品种资源所提供，其中引进法国品种2份、黑龙江省品种3份、山西省品种24份、陕西省品种16份、内蒙古自治区品种1份、贵州省品种1份、河北省品种1份、北京市品种2份。具体品种名称、来源等信息见表1。

1.2 试验设计

试验于2018年5月20日—7月5日在山西省农业科学院旱地农业研究中心旱棚进行，采用盆栽法，选用20 cm(盆口直径)×20 cm(高)×18 cm(盆底直径)的塑料盆作为试验用盆，盆土用育苗土与蛭石按1∶1等量混合，每盆装土10 kg，5月20日播种，播前浇水，使盆土达到最大持水量，每个品种种植6盆，每盆播种6穴，每穴2粒，播后覆土1 kg。出苗后进行间苗，每盆保留均匀生长的幼苗6株，正常供水，使其正常生长，待幼苗长至第1个三出复叶完全展开时(6月5日)进行干旱胁迫处理，将材料分成2组，一组继续正常供水，作为对照(CK)；另一组停止供水，进行自然干旱处理。待40%左右的材料出现严重水分胁迫症状时(6月17日，断水12 d)，取样测定各项指标[14]。然后进行复水，使盆土达到最大持水量，复水3 d后再进行取样测定相关指标。

1.3 测定项目与方法

株高用直尺直接测量；叶片相对含水量(relative water content, RWC)参照孙群等[15]的方法，采用烘干称重法测定；叶绿素相对含量参照汪明华等[16]的方法，利用SPAD-502叶绿素仪(柯尼卡美能达，日本)测定，每株选择3片上层三出复叶的中间叶片测定叶绿素相对含量；生理指标参照孙群等[15]植物生理学研究技术的方法进行测定：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性采用氮蓝四唑光还原法检测；过氧化物酶(peroxidase, POD)活性采用愈创木酚比色法测定；丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量采用硫代巴比妥酸法测定。以上指标均重复3次，取平均值。

1.4 数据处理与统计分析

利用Excel 2007对试验数据进行整理分析，用DPS 18.10对试验数据进行相关分析、主成分分析、聚类分析及逐步回归分析。参照刘海卿等[17]、汪灿等[12,18-19]、张彦军等[20]的方法分别计算各单项指标的抗旱系数(drought resistance coefficient, DC)、综合指标隶属函数值[subordinative function value,μ(xi)]和抗旱性度量值(drought resistance comprehensive evaluation value,D)。计算公式如下：

DC=处理测定值/对照测定值

(1)

负向指标的抗旱系数DC=-处理测定值/对照测定值

(2)

(3)

由公式(3)计算各综合指标的隶属函数值，式中，xi、ximin和ximax分别表示第i个综合指标及第i个综合指标的最小值和最大值。

(4)

(5)

分别按公式(4)和(5)计算各综合指标的因子权重(ωi)和抗旱性度量值(D)。式中，ωi表示第i个综合指标在所有综合指标中的重要程度；pi为第i个综合指标的贡献率。

2 结果与分析

2.1 各单项指标的抗旱系数分析

与对照相比，供试材料在干旱胁迫处理和复水后，各指标均发生了不同程度的变化(表2、3)。干旱胁迫后，叶片MDA含量和SOD、POD活性的抗旱系数平均值的绝对值均大于1，说明水分胁迫后，叶片MDA含量和SOD、POD活性均升高，绝对值越大，升高幅度越大；复水3 d后，叶片MDA含量和SOD、POD活性的抗旱系数平均值与干旱胁迫下的数值相比，都有不同程度地下降。由此可见，植物受到胁迫后，SOD、POD活性升高用以帮助植物清除氧自由基，且抗氧化物酶活性越高，植物抗旱性越强；MDA含量为负向指标能够体现出叶片膜脂过氧化的程度，含量越高，抗旱性越弱，复水后，含量降低的幅度越大，抗旱性越强。

表1 试验材料Table 1 Material list

干旱胁迫后，相对叶绿素含量、相对含水量和株高的抗旱系数平均值小于1，说明水分胁迫后，相对叶绿素含量、相对含水量和株高降低；复水3 d后，相对叶绿素含量的抗旱系数平均值小于干旱胁迫下的数值，相对含水量抗旱系数平均值大于干旱胁迫下的数值，说明复水后，相对叶绿素含量继续降低，相对含水量则升高。由此可知，在水分胁迫下，叶绿素大量降解，使光合作用降低，复水后，相对叶绿素含量继续降低，这可能与复水的时间长短有关，即时间过短，不能使相对叶绿素含量迅速恢复。相对含水量在干旱胁迫和复水中能够体现出植物的保水能力和恢复能力，干旱胁迫后，相对含水量降低，说明植物出现了萎蔫的情况，降幅越大，植物萎蔫的程度越严重，复水后，相对含水量升高，说明植物的萎蔫情况得到了缓解，升幅越大，植物的恢复能力越强，抗旱性随之越强。

由此可见，普通菜豆的各单项指标的变化和变化幅度不完全相同，很难用单一指标说明材料的抗旱性，因此需要利用多个指标通过综合分析的方法进行评价。

表2 断水12 d后各单项指标的抗旱系数Table 2 Drought resistance coefficients of single index after 12 days without water supply

表3 复水3 d后各单项指标的抗旱系数Table 3 Drought resistance coefficients of single index after rewatering for 3 days

2.2 抗旱性综合评价

2.2.1 主成分分析 利用DPS 18.1软件分别对水分胁迫和复水后的单项指标的抗旱系数进行主成分分析(表4、5)，水分胁迫和复水后的前4个综合评价指标的贡献率分别为26.443%、23.125%、18.283%、12.551%和29.533%、27.854%、17.992%、13.399%，累计贡献率分别达到80.402%和88.778%，特征值的累计贡献率均超过了80%，因此前4个因子足以反应该数据的绝大部分信息，分别用F1、F2、F3、F4和F1′、F2′、F3′、F4′来表示。在F1中胁迫后的POD活性有较高的载荷量，在F2中胁迫后的MDA含量有较高的载荷量，在F3中胁迫后的株高有较高的载荷量，F4中胁迫后的SOD活性有较高的载荷量；在F1′中复水后的叶绿素含量有较高的载荷量，在F2′中复水后的SOD活性有较高的载荷量，在F3′中复水后的MDA含量有较高的载荷量，在F4′中复水后的相对含水量有较高的载荷量。

表4 断水12 d后各综合指标载荷矩阵及贡献率Table 4 Component matrix and cumulative contribute rate after 12 days without water supply

2.2.2D值及综合评价 根据公式(2)(3)(4)可以得出各供试材料胁迫和复水后的抗旱性度量值D值(表6)，两者的D值分别介于0.215～0.778 和0.168～0.831，平均值分别为0.656 和0.617，变异系数分别为19.5%和21.4%，根据各自的D值对供试材料进行排序，结果表明，两种方法对供试材料的抗旱性排序虽然不完全相同，但是相同率很高，例如干旱胁迫下的D值排序前10的材料，分别在复水后D值的排序中排名第8、第29、第10、第4、第12、第3、第9、第5、第17、第11位。

表5 复水3 d后各综合指标载荷矩阵及贡献率Table 5 Component matrix and cumulative contribute rate after rewatering for 3 days

2.2.3 聚类分析及抗旱级别划分 采用欧式距离可变类平均法对50个供试材料的D值进行系统聚类(图1)，当距离约在0.4和0.6处时，可将50个供试材料的胁迫和复水的抗旱性聚为3类，分别为高抗、中抗和低抗。由表7可知，在胁迫12 d后的聚类结果中，筛选出高抗材料34份，占总数的68%；中抗材料9份，占总数的18%；低抗材料7份，占总数的14%。在复水3 d后的聚类结果中高抗材料、中抗材料和低抗材料分别为11、37和2份，分别占总数的22%、74%和4%。其中，复水3 d后筛选出的10份高抗材料和2份低抗材料与胁迫12 d后筛选出高抗材料和低抗材料完全相同；胁迫12 d后筛选出的9份中抗材料中的8份与复水3 d后筛选出的中抗材料完全相同；胁迫12 d后筛选出的其余24份高抗材料、其余5份低抗和1份中抗材料分别归于复水3 d后的中抗和高抗材料中。从各个材料在胁迫和复水过程中的生理指标的变化来看，两种方法筛选出的完全相同的10份高抗材料，在受到胁迫时，叶片细胞膜脂过氧化作用较轻，SOD活性和POD活性迅速升高，复水后，MDA含量降幅较大，叶片细胞膜损害受到修复的程度更深，质膜透性减小；C33安播和C24红豆这两份材料在受到胁迫时，叶片细胞膜脂过氧化作用严重，SOD活性和POD活性升高较小，复水后，MDA含量降幅较小，叶片细胞膜损害受到修复的程度较低，表现出较弱的抗旱性；两种方法筛选出相同的8份中抗材料的抗旱表现则介于高抗和低抗之间。

表6 供试材料抗旱性评价的D值Table 6 D value of drought resistance evaluation in tested Materials

表6(续)

图1 基于D值的供试材料抗旱性系统聚类图Fig.1 Fuzzy clustering dendrogram of drought resistance in tested materials based on D value

表7 供试材料抗旱性的聚类分析结果Table 7 Cluster analysis for the drought resistance of tested Materials

表7(续)

2.3 抗旱指标筛选

以断水12 d后和复水3 d后的D值为因变量，以两者各个指标的抗旱系数为自变量分别进行逐步回归分析，得到各自的回归方程，两个回归方程的决定系数分别为R2=0.999 和R2=0.998，P=0.000 1达极显著水平(表8)，说明上述回归方程拟合度好，可以用于普通菜豆苗期的抗旱性评价。由两个回归方程可知，断水12 d后的SOD活性、MDA含量、POD活性、相对含水量、株高和复水3 d后的 SOD活性、MDA含量、相对叶绿素含量、相对含水量对普通菜豆苗期抗旱性有显著影响，可作为普通菜豆苗期抗旱性鉴定的指标。由表9、10可知，断水12 d后SOD活性(x1)、POD活性(x3)和复水3 d后相对叶绿素含量(x′3)、相对含水量(x′4)与各自D值呈显著相关性；断水12 d后MDA含量(x2)和复水3 d后MDA含量(x′2)与各自D值呈极显著相关性。说明断水12 d后MDA含量(x2)和复水3 d后MDA含量(x′2)对各自D值的直接作用大于间接作用总和，两者对各自D值起主要作用，而其余指标对各自D值的贡献主要是通过断水12 d后MDA含量(x2)和复水3 d后MDA含量(x′2)间接实现的。

表8 供试材料抗旱性模型预测Table 8 Model predict of drought resistance in tested Materials

3 讨论

3.1 干旱胁迫和复水对普通菜豆苗期形态及生理特性的影响

普通菜豆大多生长在自然环境恶劣、土地贫瘠的干旱冷凉区，在长期的生长过程中形成了复杂的抗逆生理机制。张美俊等[21]研究表明，逆境可导致植株的形态和生理生化指标发生改变。本研究表明，在干旱胁迫下，与对照相比，植株株高普遍变矮，相对叶绿素含量和相对含水量下降，叶片MDA含量和SOD、POD活性升高，且抗旱性越强的品种株高和相对含水量下降越少，SOD活性和POD活性升高得越多，MDA积累得越少。Turkan等[22]研究指出，耐旱品种的脯氨酸积累量、SOD活性、过氧化氢酶(catalase, CAT)活性均高于敏感品种，并且能保持更高的气孔导度，耐旱品种通过保持较高的抗氧化酶活性，从而减弱活性氧对机体的损伤。邵惠芳[23]等通过研究豫烟10号和豫烟12号两种烟草幼苗叶片在不同干旱胁迫下生理指标发现，在干旱胁迫下仍保持较强的抗氧化酶活性是豫烟12号耐旱的主要生理原因。本研究同样发现，在苗期，抗旱性强的品种在水分亏缺的状态下，通过维持地上部一定的营养生长，为生殖生长提供坚实的基础；同时抗旱性强的品种可以维持较高的叶片保水能力和SOD、POD活性，从而较好地保持自身叶片的水分平衡，快速清除干旱胁迫环境下产生的有害成分，减轻MDA积累对植株的伤害，以保证植株在干旱环境下能够更好地生长。

表9 断水12 d后各指标与D值的通径分析Table 9 Path analysis of single index and Dvalue after 12 days without water supply

表10 复水3 d后各指标与D值的通径分析Table 10 Path analysis of single index and D value after rewatering for 3 days

复水后，植株恢复的快慢和程度与品种的抗旱性关系紧密。徐颖等[24]通过对13个类型盆栽海棠的干旱及复水后的叶片净光合速率(net photosynthesis rate, Pn)，蒸腾速率(transpiration rate, Tr)及水分利用效率(water use efficiency, WUE)进行研究，发现在干旱胁迫下维持高水平的Pn和WUE以及复水后能够很快恢复甚至超过原初状态的点种更有利于适应干旱。本试验通过研究复水3 d后不同品种生理指标的变化来说明复水后植物的表现与抗旱性的关系，结果表明，与干旱胁迫相比，复水后MDA含量均有不同程度地下降，相对含水量有小幅度上升，抗旱性强的品种在复水后SOD活性、POD活性和叶片相对含水量能维持较高水平且MDA含量大幅度降低。由此可知，复水后植物各个生理指标的变化与植物的抗旱性关系很紧密，将植物复水后的生理指标与干旱胁迫后的生理指标进行两相比较，可以更科学准确地鉴定植物的抗旱性。

3.2 普通菜豆苗期抗旱性评价方法的选择

目前，前人对多种作物不同生育时期的抗旱性鉴定都采用了隶属函数法、主成分分析法和D值等综合评价方法[25-27]。路之娟等[28]采用D值评价不同基因型苦荞的耐旱能力，并将参试品种划分为耐旱型、中间型和不耐旱型，鉴定结果较为理想。汪灿等[19]以D值、综合抗旱系数(comprehensive drought resistance coefficient, CDC)、加权抗旱系数(weight drought resisitance coefficient, WDC)为标准对参试材料进行抗旱性排序，结果基本相同，但只有基于D值的聚类分析结果与各材料在田间的实际抗旱表现更接近，且与产量的相关性最为密切。D值是一个无量纲的纯数，使得不同品种间的抗旱性差异具有可比性，是一种比较可靠的评价方法[29]。本试验分别对干旱胁迫和复水的D值进行聚类，根据聚类结果分别对从试材料进行抗旱级别分类，可分为高抗、中抗和低抗3类，两者总体分类结果的一致率(划分在相同级别)达到40%，邻级率(划分在相邻级别)为60%，未出现跨级的材料，由此说明这两种研究方法的一致性很好。尤其是在高抗和低抗的品种分类中，复水后筛选出的品种与干旱胁迫后筛选出的品种重叠部分分别达到了90%和100%，进一步说明了复水后的抗旱性在普通菜豆苗期抗旱性综合评价中的验证补充作用。本研究将复水后普通菜豆的抗旱性引入到普通菜豆苗期综合抗旱性的评价中，改变了以往在苗期抗旱性鉴定中只依靠干旱胁迫后的指标综合评价的单一性，这两种研究方法的结合使得鉴定结果更加科学和准确。

3.3 普通菜豆苗期抗旱性鉴定指标的筛选

作物的抗旱性很复杂，是众多因素和多种机制共同作用的结果，不同作物在不同时期的抗旱机制也不同[30-33]。对普通菜豆苗期的抗旱性进行鉴定，指标的合理选择尤为重要。国内外学者在不同作物苗期的抗旱性鉴定方面做了大量的工作，发现多种性状和指标都与抗旱性有关。例如，赵利等[34]采用苗期反复干旱法，对16份胡麻品种进行苗期抗旱性鉴定，发现根冠比和反复干旱成活率可作为胡麻苗期抗旱性鉴定的指标；Munoz-Perea等[35]在干旱胁迫和非胁迫环境下，对6个中粒普通菜豆品种进行评价，发现水分利用效率在这些品种中差异显著；Lizana等[36]在智利和玻利维亚的不同地点测定了24个菜豆品种的产量和光合特性，发现耐旱品种在气孔导度、光合速率等方面表现出极大的可塑性；李龙等[7]根据各性状指标与综合抗旱指数的关联度筛选出叶片相对含水量、相对叶绿素含量及PSⅡ最大量子产量3个与抗旱性关系最为密切的指标，认为在普通菜豆苗期抗旱性鉴定中应注重叶片生理指标的选用。本研究选取断水12 d后和复水3 d后的形态和生理指标，发现这些指标与普通菜豆的抗旱性都有不同程度的相关性。通过逐步回归分析及进一步的通径分析得到与D值显著相关的指标有断水12 d后的SOD活性、MDA含量、POD活性、相对含水量、株高和复水3 d后的SOD活性、MDA含量、叶绿素含量、相对含水量，且两者的MDA含量与各自D值呈极显著相关性。由此可见，普通菜豆苗期的抗旱性鉴定中生理指标的测定尤为重要，尤其是干旱胁迫和复水后的MDA含量，可作为普通菜豆苗期抗旱性鉴定的有效评价指标。

本试验是在盆栽的条件下研究了不同菜豆品种苗期胁迫12 d(重度胁迫)和复水3 d后的抗旱性，而对于菜豆在不同生育期及不同的胁迫程度(轻度胁迫、中度胁迫和重度胁迫)和复水后不同时间(复水1、2和3 d)下各自对抗旱性的影响方面仍有待进一步研究。

4 结论

本研究发现，普通菜豆复水后的生理指标与苗期的抗旱性关系紧密，在此基础上确定了干旱胁迫和复水后两者D值互相比较验证的抗旱性综合评价方法。本试验还发现，普通菜豆苗期干旱胁迫和复水后的MDA含量可有效用于普通菜豆资源的抗旱性鉴定中，从而简化鉴定筛选工作。