油菜素内酯对小麦幼苗抗旱性的诱导效应

华智锐+李小玲

摘要：以商麦1619为材料，在PEG6000模拟干旱条件下，研究不同浓度（0、1、0.1、0.01、0.001 mg/L）油菜素内酯（BR）对小麦幼苗抗旱性的诱导效应。通过测定小麦幼苗抗旱性相关生理指标，比较分析油菜素内酯对小麦幼苗干旱胁迫的缓解效应。结果表明，在干旱条件下，经BR处理的小麦幼苗超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化氢酶（CAT）活性均提高，丙二醛（MDA）含量降低，相对含水量提高，从而提高了小麦幼苗的抗旱性。其中，0.1 mg/L BR对提高小麦幼苗的抗旱性作用效果最佳。

关键词：油菜素内酯；小麦；幼苗；抗旱性

中图分类号： S512.101 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）01-0062-04

油菜素内酯（brassinolide，简称BR）又称芸薹素内酯或芸苔素，它是一种甾类化合物，广泛存在于植物界，对植物生长发育有多方面的调节作用[1-2]。油菜素内酯是一种新型的、生理活性强、无毒的植物激素，作用机理类似于生长素，由于其生理活性大大超过了现有的5种激素，已被国际上誉为第六大激素，对植物生长发育有着多方面的重要影响，其主要的生理效应是促进细胞生长和分裂，促进植物光合作用，提高植物的抗逆性，具体表现为提高植物的抗旱[3-9]、抗盐[10]、抗氧化[11-12]能力，在自然条件不利时更是突出，又称逆境条件的缓和剂[1-2]。BR可以增强玉米[3-4]等作物的抗旱性，从而提高产量和品质，还可以提高羊草、沙棘、花椰菜[5-7]等抗旱性，提高苗木[8-9]的抗旱性。

商洛市位于陕西省秦岭南麓东段，地势复杂，自然灾害频发，耕地肥力水平低，粮食产量一直没有大的突破。尤其是小麦品种“多、乱、杂”现象严重，缺乏抗病虫、抗倒伏、抗旱耐寒、高产稳产的优质品种，“干旱、严寒、病虫”一直都是商洛小麦的几大胁迫因子。其中，干旱是小麦生产的主要问题。选育出抗旱、高产、稳产的小麦新品种是提高旱地小麦产量、促进小麦大规模持续稳定增产、保障国家粮食安全的有效途径之一。目前干旱地区小麦生产推广的主要品种，虽然有较强的适应性，但小麦抗旱性较差，而且加工品质很难满足人们生活的需要[13]。

商麦1619是在商麦5226基础上选育的高产小麦新品种，通过10多年系统选育而成，是针对商洛旱地小麦育种现状，根据抗旱、优质、高产、综合农业性状优良的育种要求而育成的适宜旱塬、旱坪地种植的优质高产小麦新品种[14]。

本试验以商麦1619為材料，在20%聚乙二醇（PEG）[15-16]模拟干旱条件下，研究外源油菜素内酯对小麦幼苗抗旱性的诱导效应。通过测定小麦幼苗抗旱性相关生理指标，比较分析油菜素内酯对小麦幼苗干旱胁迫的缓解效应，为油菜素内酯在农作物抗旱应用上提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

供试验的小麦品种为商洛学院培育的优质小麦新品种商麦1619。选取饱满、均匀一致的小麦种子，用75%乙醇消毒10 min，再用蒸馏水冲洗干净，室温浸泡6 h。一批种于18个培养皿内，每皿30粒，试验共设2个对照[分别是CK1（蒸馏水对照）、CK2（20% PEG对照）]和4个处理（T1，20% PEG+BR 0.001 mg/L；T2，20% PEG+BR 0.01mg/L；T3，20% PEG+BR 0.1mg/L；T4，20% PEG+BR 1 mg/L），每个处理3次重复，测定小麦种子的发芽率和发芽势；另一批种于25个培养皿内，每皿30粒，待长到2叶1心时，用20% PEG6000模拟干旱处理小麦幼苗，培养2～3 d后，以不喷施BR为对照组（CK），其余4个处理分别喷施1、0.1、0.01、0.001 mg/L BR，上午、下午各1次，每个处理5次重复，分时间段（1、3、5、7、9 d）测定小麦幼苗抗旱性生理指标，选出对小麦抗旱性影响最适的BR浓度。

1.2 试验指标测定方法

1.2.1 小麦种子发芽率与发芽势的测定 选取饱满、均匀一致的小麦种子，用75%乙醇消毒10 min，再用蒸馏水冲洗干净，室温浸泡6 h。种于18个培养皿内，每皿30粒，试验共设2个对照（蒸馏水、20% PEG）和4个处理（20% PEG+BR 1 mg/L，20% PEG+BR 0.1 mg/L，20% PEG+BR 0.01 mg/L，20% PEG+BR 0.001 mg/L），每个处理3次重复[17]。

测定小麦种子的发芽率和发芽势：

发芽率（GR）=∑GtN×100%。

式中：Gt表示7 d内正常发芽的种子数；N表示供试种子数。

发芽势（GP）=n4N。

式中：n4表示4 d内正常发芽的种子数；N表示供试种子数。

1.2.2 小麦幼苗相对含水量的测定 将小麦幼苗叶片剪成小块，称取同等质量的2份（mf），1份于150～160 ℃烘箱中烘烤0.5～1 h，然后称此时的干质量（md），1份放入蒸馏水中浸泡 70 min，当达到恒质量时，称此时的质量（mt）[17]。

相对含水量=（鲜质量mf-干质量md）/（饱和鲜质量mt-干质量md）×100%。

1.2.3 小麦幼苗丙二醛（MDA）含量的测定 称取小麦幼苗叶片0.3 g，放入冰浴的研钵中，加入少量石英砂和2 mL 0.05 mol/L 磷酸缓冲液（pH值7.8），研磨成匀浆。将匀浆移到试管中，再用2～3 mL 0.05 mol/L磷酸缓冲液（pH值78），冲洗研钵2次，合并提取液。然后在提取液中加入 5 mL 0.5%硫代巴比妥酸溶液，摇匀。将试管放入到沸水浴中煮沸10 min（当试管内溶液中出现小气泡开始计时），到时间后，迅速将试管取出放入到冷水浴中。直到试管内溶液冷却后，取3 000 g溶液离心15 min，取上清液并测量其体积。用0.5%硫代巴比妥酸作为空白测532、600、450 nm处的吸光度[18]。

按下式计算MDA含量：

MDA含量（μmol/g，FW）=[6.542×（D532 nm-D600 nm）-0599×D450 nm]×Vt/Vs×mf。

式中：Vt为提取液的总体积，mL；Vs为测定时用提取液的体积，mL；mf为样品鲜质量，g。

1.2.4 小麦幼苗超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定 （1）酶液的提取。取待测小麦幼苗叶片0.5 g放入冰浴的研钵中，加 2 mL 预冷的提取介质（pH值7.8的0.05 mol/L磷酸缓冲液内含1%聚乙烯吡咯烷酮），冰浴情况下研磨成匀浆，加入提取介质冲洗研钵，并使终体积定容至10 mL，在4 ℃下 10 500 r/min 离心20 min，上清液为SOD粗提液。

（2）显色反应。选取透明度好，质地一致的试管4支，2支为测定管，2支为对照管，按照表1所示加入试剂。混匀后，给其中1支对照管罩上比试管稍长一些的双侧黑色硬纸套遮光，与其他各管同时放在光照培养箱内反应10～20 min（各个管照光情况一致，反应温度控制在25～35 ℃之间，根据酶活性适当调整酶的浓度和反应时间）。

（3）SOD活性的测定与计算。待反应结束后，用黑布罩住试管，终止反应。以遮光的对照管作为空白，分别在 560 nm 处测定各试管的吸光度[19]。

按下式计算SOD活性：

SOD活性（U/g，FW）=（Do-Ds）·VT/（0.5D0·mf·V1）。

式中：D0为照光对照管的吸光度；Ds为测定管的吸光度；VT为样品液总体积，mL；V1为测定时样品液用量，mL；mf为样品鲜质量，g。

1.2.5 小麦幼苗过氧化氢酶（CAT）活性的测定 （1）酶提取液。称取小麦幼苗叶片1 g置于预冷的研钵中，加适量 0.05 mol/L 磷酸缓冲液（pH值=7.0）及少量石英砂，在冰浴上研磨成匀浆，转移至10 mL量瓶中，用磷酸缓冲液冲洗研钵2次（每次2 mL），合并冲洗液移至容量瓶中，定容至10 mL，摇匀。量取提取液5 mL于离心管中，在4 ℃、15 000 r/min下离心15 min，倒出上清液即为酶粗提液，4 ℃下保存。

（2）测定方法。选取10 mL具塞试管，加入2 mL酶提取液置于沸水浴中加热煮死酶，冷却备用；另选取10 mL试管4支，3支为测定管（3个重复），1支为对照管。按表2加入试剂。

将以上4支试管于25 ℃水浴锅中预热3 min后，再逐管加入0.2 mL 200 mmol/L H2O2溶液，每加1管迅速倒入石英比色皿中。然后在紫外分光度计上测定D240 nm（蒸馏水调零），每隔30 s讀数1次，共测3 min，记录数据[19]。

（3）结果计算。以1 min内D240 nm减少0.1（3支测定管的平均值）的酶量为1个酶活性单位（U）。先求出3支试管各自 1 min 内D240 nm减少值，公式如下：

CAT活性[U/（g·min），FW]=ΔD240 nm×Vt/0.1×Vs×t×mf。

式中：ΔD240 nm=DS0-（DS1+DS2+DS3）/3，Ds0为加入煮死酶液对照管吸光度；Ds1、Ds2、Ds3为样品测定管吸光度；Vt为粗酶提取液总体积；Vs为测定时取粗酶液体积，mL；mf为样品鲜质量，g。

1.3 数据处理

所有处理每次测定重复3次，数据为3次测定值的平均值，用Excel进行数据统计与分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理下小麦种子发芽率与发芽势的测定

如图1所示，CK2，小麦种子的GR、GP都低于CK1，说明干旱胁迫对小麦种子的萌发有强烈的抑制作用。BR浓度为0.1 mg/L时GR、GP达到最大，GP达到11.7%，GR相对于CK2提高了70百分点。BR浓度为0.001、0.01、1 mg/L 时，GR相对于CK2分别提高1.7、4.5、3.3百分点，GP分别为67%、9.5%、8.3%。由此可见，随BR浓度的升高，GR和GP都呈现出先升后降的趋势，但仍高于CK2。说明施加BR，可以提高小麦种子的抗旱性，利于种子萌发。

2.2 不同浓度BR对小麦幼苗相对含水量的影响

由图2可知，经不同浓度BR处理的小麦幼苗相对含水量较对照组均有明显的提高。随着干旱胁迫时间的延长，同一浓度BR对小麦幼苗相对含水量的影响也在不断变化，整体表现为先下降后上升的趋势。7 d后达到最低水平，就试验组而言，0.001 mg/L BR作用效果最弱，但仍高于对照组，提高了10.9百分点，0.1 mg/L BR效果最好，提高了17.8百分点，说明BR可保持植物体内水分，抗旱性强。

2.3 不同浓度BR对小麦幼苗丙二醛含量的影响

由图3可知，对照组在干旱胁迫下，MDA含量一直呈缓慢上升趋势，而经BR处理过的试验组小麦幼苗MDA含量在同一时间均低于对照组，说明BR可缓解膜脂过氧化的过程，降低丙二醛的含量。不同浓度BR对小麦幼苗MDA的影响程度是不同的，就同一天来说，随着BR浓度的增大，MDA含量呈先下降后上升的趋势，其中0.1 mg/L BR效果最为明显，在9 d后时相对于对照组降低的比例最大，降低了53.3%。

2.4 不同浓度BR对小麦幼苗SOD和CAT活性的影响

由图4、图5可知，SOD和CAT活性变化趋势相似，经不同浓度BR处理的试验组小麦幼苗超氧化物歧化酶（SOD）活性和过氧化氢酶（CAT）活性均高于对照组，呈缓慢上升趋势，说明BR具有提高小麦幼苗SOD、CAT活性的作用。就同一天来说，随着BR浓度的增大，SOD、CAT含量呈先上升后下降的趋势，其中0.1 mg/L BR效果最为明显，在9 d后相对于对照组上升的比例最大，SOD提高了127.06%，CAT提高了99.54%，而在1 d后相对于对照组上升的比例最小，SOD提高了28.18%，CAT提高了31.85%；施加BR对小麦幼苗SOD、CAT活性的影响又是不同的，随着干旱胁迫时间的延长，0.1 mg/L BR对小麦幼苗的影响明显，SOD活性在9 d后上升的比例比1 d后上升的比例提高了98.88百分点，CAT活性在9 d后上升的比例比1 d后上升的比例提高了67.74百分点，说明干旱胁迫下，BR对小麦幼苗SOD的缓解作用比CAT高。

3 结论与讨论

油菜素内酯是20世纪末被发现的一种新型植物激素，其作用不同于以往的五大类激素。大量研究表明，科学使用油菜素内酯能有效改善高温、重金属、干旱、低氧等不良环境下植物的抗氧化性能，减少其膜脂过氧化程度，从而促进植物的光合作用及干物质积累，减轻逆境伤害[1-2]。

发芽率（GR）反映了种子发芽的量，发芽势（GP）则反映了种子发芽的快慢和整齐度。干旱胁迫下，小麦种子的发芽率与发芽势明显下降，说明干旱胁迫对小麦种子的萌发有强烈的抑制作用。当施加不同浓度BR后，处理组相对于干旱胁迫下小麦种子的发芽率与发芽势都有明显的提高。

植物体内含水量直接影响植物的新陈代谢。干旱条件下，植物细胞原生质膜丧失选择透性，会引起植物细胞代谢紊乱，经不同浓度BR处理的小麦幼苗相对含水量都有所提高。随着干旱胁迫时间的延长，同一浓度BR对小麦幼苗相对含水量的影响是不同的，呈先下降后上升的趋势。7 d后达到最低水平，就试验组而言，0.001 mg/L BR作用效果最弱，但仍高于对照组，提高15.2%；0.1 mg/L BR效果最好，提高了19.8%，说明BR可保持植物体内水分，抗旱性作用强。

丙二醛（MDA）是膜脂过氧化最重要的产物之一，可通过测定MDA的含量了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程序以及植物的抗逆性。干旱胁迫下MDA含量可以说明植物生物膜受伤害的程度以及植物抗旱性的能力。干旱胁迫下，MDA含量一直呈缓慢上升趋势，而经BR处理过的小麦幼苗MDA含量在同一时间均低于对照组，说明BR可缓解膜脂过氧化程度，降低丙二醛的含量，就同一天来说，随着BR浓度的增大，MDA含量呈先下降后上升的趋势，其中 0.1 mg/L BR效果最为明显，在9 d后时相对于对照组降低的比例最大，降低了53.3%。

超氧化物歧化酶是生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，它与植物的衰老和抗逆性密切相关，是植物体内重要的保护酶之一。SOD是機体内天然存在的超氧自由基清除因子，可以与超氧物阴离子自由基（ O-2· ）发生歧化反应，生成O2和H2O2，生成的H2O2可被过氧化氢酶（CAT）分解为O2和H2O，以避免H2O2积累对细胞的氧化破坏作用。因此，SOD、CAT活性的测定在植物衰老和抗逆性研究中有着重要的意义。干旱胁迫下，BR对小麦幼苗SOD和CAT活性缓解趋势相似，经不同浓度BR处理的小麦幼苗，其超氧化物歧化酶（SOD）活性和过氧化氢酶（CAT）活性均高于对照组，呈缓慢上升趋势，说明BR具有提高小麦幼苗SOD、CAT活性的作用。其中0.1 mg/L BR效果最为明显，在第9 d时相对于对照组上升的比例最大，SOD提高了12706%，CAT提高了99.54%；施加BR对小麦幼苗SOD、CAT活性的影响又是不同的，随着胁迫时间的延长，0.1 mg/L BR对小麦幼苗的影响明显，SOD活性在9 d后上升的幅度比1 d后上升的幅度提高了98.88百分点，CAT在9 d后上升的幅度比第1 d上升的幅度提高了67.74百分点，同时说明干旱胁迫下，BR对小麦幼苗SOD活性的缓解作用比CAT活性高。

周天等研究结果表明，经油菜素内酯处理的玉米幼苗相对含水量提高，从而提高了幼苗的抗旱性[3]。而在用油菜素内酯处理的几个浓度中，0.1 mg/L油菜素内酯对提高玉米的抗旱性效果最好。韩德复等结果表明，经BR处理的羊草叶片相对含水量提高，从而提高了羊草的抗旱性。其中，0.1 mg/L BR对提高羊草的抗旱性效果最好[5]。李凯荣等研究发现，天然油菜素内酯处理增加了叶片含水量，降低了丙二醛含量，增强了超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性[9]，表明天然油菜素内酯处理提高了侧柏苗木的抗旱性。本研究以油菜素内酯作为外源物质，干旱胁迫下，用不同浓度的BR处理小麦幼苗，结果表明，相对含水量提高，丙二醛（MAD）含量下降，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性提高，从而增强了小麦幼苗的抗旱能力。其中，0.1 mg/L BR对提高小麦幼苗的抗旱性作用效果最好，该结果与前人的相关研究结论[3，5，9]相一致。但商麦1619小麦抗旱性的研究，仍然需要后续更多指标测定和大田抗旱性稳定性状表现的进一步验证和探讨。

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