干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)3MP-5-3产β-甘露聚糖酶条件优化

王 烁，季海蕊，那瑞莹，曹慧莹，赵 丹, *

(黑龙江大学 a.生命科学学院微生物省高校重点实验室，哈尔滨 150080；b.农业微生物技术教育部工程研究中心，哈尔滨 150500)

0 引 言

β-甘露聚糖酶(β-mannanase，EC 3.2.1.78，以下简称甘露聚糖酶)，是能够水解葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、半乳葡甘露聚糖和均一甘露聚糖的内切水解酶，属于半纤维素酶类。甘露聚糖酶的作用位点是β-1,4-D-吡喃糖苷键，水解产物甘露低聚糖能够降胆固醇、降血糖，可用作食品添加剂[1]。甘露聚糖酶本身也可作为纸张漂白剂、饲料添加剂、植物油提取剂，还具有降低咖啡提取物黏度，提高果汁产量和果汁澄清度的作用，实现在造纸、饲料和食品等领域的广泛应用[2-3]。

甘露聚糖酶普遍存在于动植物和微生物中，由于来源广泛、周期短和易于大规模生产等特点，微生物来源的甘露聚糖酶得到国内外的重点关注。产甘露聚糖酶的菌株主要包括曲霉属(Aspergillus)[4]、青霉菌属(Penicillium)[5]、芽孢杆菌属(Bacillus)[6]和假单胞菌属(Pseudomonas)[7]等。但由于生物安全性的限制和影响，上述菌株来源的甘露聚糖酶需经过纯化，否则无法满足食品领域对高安全性酶的需求。

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)作为公认的安全性(Generally regarded as safe，GRAS)菌株，在食品和药品等领域得到广泛应用[8]。目前报道的产甘露聚糖酶乳酸菌仅有5种，分别为乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)M17[9]、绿色魏斯氏菌(Weissellaviridescens)LB37[10]、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)RI11[11]、ATCC14917TM[12]和M24[13]以及干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)HDS- 01[3]。挖掘产甘露聚糖酶乳酸菌资源并优化提高产酶水平，才能满足甘露聚糖酶在食品级领域日益增长的应用需求。微生物产甘露聚糖酶能力受培养基组分和发酵条件影响，单因素试验是最直接有效的优化方法。Khattab O H等[14]通过单因素优化桔青霉(Penicilliumcitrinium)150GY发酵条件，菌株酶活优化后达到26.50 IU·mL-1，相较于优化前的16.82 IU·mL-1提高了57.55%。

本研究以L.casei3MP-5-3为供试菌株，通过改变培养基组分和培养条件，以甘露聚糖酶酶活和生物量为指标，确定菌株产酶的最适条件。

1 材料与方法

1.1 供试菌株与培养基

供试菌株3MP-5-3分离自东北酸菜发酵液，保藏于黑龙江大学微生物重点实验室。

MRS培养基(g·L-1)：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母浸粉5，磷酸氢二钾2，柠檬酸铵2，无水亚硫酸钠0.1，硫酸镁0.2，硫酸锰0.05，无水乙酸钠5，吐温80 1 mL；pH 5.5；121 ℃灭菌15 min，用于菌株的活化。

1.2 主要试剂

魔芋粉购自四川新星魔芋粉厂；甘露糖标准品购自上海楷洋生物技术有限公司；角豆胶购自Sigma Alrich公司(CAS：9000- 40-2)。

1.3 实验方法

1.3.1 菌种活化

取-80 ℃冰箱内保藏菌种按2%(v/v)接种量转接至YPD液体培养基，30 ℃培养24 h活化2代后备用。

1.3.2L.casei3MP-5-3生物量及甘露聚糖酶活性测定

活化好菌液转接至基础产糖培养基中，30 ℃、150 rpm·min-1、发酵140 h，将发酵液适当稀释，以相同稀释倍数基础产糖培养基为空白对照，测定L.casei3MP-5-3发酵液600 nm下吸光度，即为L.casei3MP-5-3生物量。

发酵液10 000 rpm·min-1离心10 min，上清即为粗酶液。粗酶液2 mL和磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液0.5 mL配制pH 6.0的0.5%(w/v)角豆胶溶液。55 ℃水浴30 min后，加入3 mL DNS试剂沸水浴10 min终止反应，最后用蒸馏水定容至25 mL。以等量0.8%果胶水溶液作空白对照，540 nm测还原糖含量。1个酶活力单位定义为1 μmol·min-1还原糖所需的酶量[15]。

1.3.3 培养基组分对菌株生物量和甘露聚糖酶产量影响

1.3.3.1 碳源种类与浓度

分别以魔芋粉、角豆胶、果胶和瓜尔胶为产酶诱导物。在确定最适诱导物种类后，考察浓度分别为2、4、6、8、10 g·L-1对菌株生物量和产酶的影响。

1.3.3.2 葡萄糖浓度

培养基中添加2、4、6、8、10、12 g·L-1浓度的葡萄糖，考察菌株生物量和产酶情况。

1.3.3.3 氮源浓度

培养基选取不同浓度的3种有机氮源酵母浸粉浓度为1、3、5、7、9 g·L-1，蛋白胨浓度为6、8、10、12、14 g·L-1以及牛肉膏浓度6、8、10、12、14 g·L-1，通过对菌株生物量和产酶结果比较，确定3种有机氮源的最适浓度。并在此基础上。考察无机氮源柠檬酸铵在1、2、3、4、5 g·L-1浓度下对菌株的生物量和产酶的影响。

1.3.3.4 乙酸钠浓度

乙酸钠的添加量分别为2、4、6、8、10 g·L-1，通过菌株生物量和产酶情况筛选出最适浓度。

1.3.4 培养条件对菌株生物量和β-甘露聚糖酶产量影响

1.3.4.1 初始pH值

培养基调整pH为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，考察菌株生物量和产酶情况。

1.3.4.2 温度

菌株接种到培养基后在24、27、30、33、36 ℃温度下发酵，探究温度对菌株生物量和产酶情况的影响。

1.3.4.3 摇床转速

培养基在60、80、100、120、140 rpm·min-1的转速下培养，通过不同处理菌株生物量和产酶情况的比较，确定最适摇床转速。

1.3.4.4 接种量和装液量

按照1%、3%、5%、7%、9%的接种量进行接种，以菌株生物量和产酶情况为结果对接种量进行筛选。并向在此基础上，考察装液量分别为40 mL/250 mL、60 mL/250 mL、80 mL/250 mL、100 mL/250 mL、120 mL/250 mL、140 mL/250 mL对菌株生物量和产酶的影响。

1.3.5 数据分析

本研究主要绘图软件为SigmaPlot 10.0，采用JMP 10.0软件进行统计分析及多重比较。实验均设置3个平行，数据的表示形式为均值±标准差。采用Tukey’s方法对组间数据多重比较，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果与讨论

2.1 碳源对菌株产酶的影响

碳源种类对L.casei3MP-5-3生长及产甘露聚糖酶的影响见图1。由图1可见，角豆胶诱导产酶效果最好，魔芋粉次之。汪梦昀等[16]在研究不同碳源优化酶产量的过程中得出魔芋微粉和魔芋精粉效果显著优于其他碳源。但魔芋粉溶液黏稠度高，培养基在发酵初期呈胶状，影响菌株生物量和酶产量[17]。因此，后续研究将采用角豆胶为产酶诱导物。

图1 碳源种类对L.casei 3MP-5-3生长及产甘露聚糖酶的影响Fig.1 Effects of carbon source on growth and mannanase production of L.casei 3MP-5-3

在确定的最适碳源条件下，用不同浓度的角豆胶对菌株进行发酵，对酶活影响见图2，随着角豆胶浓度的增加，酶活先增加，在角豆胶质量浓度为6 g·L-1时达到最大值19.93±0.07 U·mL-1，随后酶活逐渐降低。因此确定6 g·L-1为最适碳源浓度。

图2 角豆胶浓度对L.casei 3MP-5-3生长及产甘露聚糖酶的影响Fig.2 Effects of carob gum concentration on growth and mannanase production of L.casei 3MP-5-3

2.2 葡萄糖对菌株产酶的影响

研究发现L.caseiHDS- 01是在由葡萄糖和魔芋粉组成的混合碳源条件下发酵产酶的，培养基内适宜含量的葡萄糖使菌株积累足够的生物量，而后菌株利用多聚糖产生甘露聚糖酶[18]。本研究利用2～12 g·L-1的葡萄糖发酵菌株3MP-5-3，其中酶活和OD值均在8 g·L-1达到最大值，分别为38.82±0.39 U·mL-1和4.26±0.04(图3)。与未添加葡萄糖之前相比酶活提高了40.6%。张鑫等[19]在培养基中添加1%浓度的葡萄糖后，酶活提高了27.2%，达到了62.8±0.27 U·mL-1。本研究通过对多聚碳源和葡萄糖的筛选将利用6 g·L-1的角豆胶和8 g·L-1的葡萄糖组成的混合碳源用于后续发酵。

图3 葡萄糖浓度对L.casei 3MP-5-3生长及产甘露聚糖酶的影响Fig.3 Effects of glucose concentration on growth and mannanase production of L.casei 3MP-5-3

2.3 氮源对菌株产酶的影响

以甘露聚糖酶酶活为检测指标筛选培养基的不同氮源浓度，结果见表1。由表1可见，分别对酵母浸粉、蛋白胨和牛肉膏3种有机氮源的不同浓度进行考察，其中酵母浸粉的最适浓度为7 g·L-1，此时酶活达到试验范围内的最大值为42.95±0.13 U·mL-1。蛋白胨的最适浓度为10 g·L-1，菌株酶活达到46.22±0.27 U·mL-1得到进一步提高。在此基础上，对牛肉膏的浓度进行筛选发现牛肉膏为10 g·L-1时，菌株酶活最大为48.80±0.39 U·mL-1。因此3种氮源均对菌株酶活的提高有积极影响，并分别确定了其最适添加浓度。研究在确定有机氮源后对无机氮源柠檬酸铵的添加量进行探索。柠檬酸铵在1～5 g·L-1下对甘露聚糖酶的产量有不同影响。当柠檬酸铵浓度达到3 g·L-1时，菌株产酶效果最优为53.79±0.13 U·mL-1。

2.4 乙酸钠对菌株产酶的影响

乙酸钠浓度对L.casei3MP-5-3生长及产甘露聚糖酶的影响见图4。由图4可见，乙酸钠的浓度达到6和8 g·L-1时，菌株酶活优于其他处理组。乙酸钠为6 g·L-1时，酶活达到55.73±0.13 U·mL-1；而乙酸钠为8 g·L-1时，酶活为55.12±0.49 U·mL-1。出于成本的考虑，本研究将乙酸钠浓度确定为6 g·L-1。

2.5 pH对菌株产酶的影响

pH过高或过低都会降低菌株产酶能力。菌株在pH=5.5偏酸性的条件下，酶活和OD值均达到最大值分别为59.51±0.20 U·mL-1和4.04±0.04(图5)，Kumar U等[20]在考察菌株米曲霉(Aspergillusoryzae)产酶的最适pH值为9，与L.casei初始pH相差较大，可能是本研究菌株为乳酸菌，在弱酸性条件下适宜其生长。

图5 初始pH对L.casei 3MP-5-3生长及产甘露聚糖酶的影响Fig.5 Effects of initial pH on growth and mannanase production of L.casei 3MP-5-3

2.6 温度对菌株产酶的影响

温度对L.casei3MP-5-3生长及产甘露聚糖酶的影响见图6。由图6可见，在一定温度范围内，菌株的酶活和OD值随着温度的升高呈现出先增加后下降的趋势，其中在33 ℃出现峰值，在此温度下甘露聚糖酶酶活达到最大值为59.73±0.20 U·mL-1。结果表明过高或过低的温度均不利于菌株的生长，影响酶的产量。熊进等[21]优化毕赤酵母(Pichiapastoris)的产酶条件时，因过高温度对蛋白质降解的影响，确定的最佳产酶条件不超过28 ℃，而汪梦昀等[16]和张鑫等[19]分别对枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和L.casei产酶条件中的温度进行优化时，结果表明两种不同种属的菌株最适温度均为37 ℃，受不同菌株种属特异性的影响其最佳产酶温度有所异同。

图6 温度对L.casei 3MP-5-3生长及产甘露聚糖酶的影响Fig.6 Effects of temperature on growth and mannanase production of L.casei 3MP-5-3

2.7 摇床转速对菌株产酶的影响

菌株在液体培养基发酵培养过程中，摇床转速对菌株生物量和酶产量的提高具有重要作用，适宜的摇床转速可使菌株在液体培养基中分散的更将均匀利于菌株对培养基组分吸收促进生长，避免某一区域过分密集造成竞争而使菌株产生竞争，抑制生长(图7)。由图7可见，在100 rpm·min-1的摇床转速下，菌株产酶效果最好，酶活达到最大值60.98±0.20 U·mL-1。

图7 摇床转速对L.casei 3MP-5-3生长及产甘露聚糖酶的影响Fig.7 Effects of shaking speed on growth and mannanase production of L.casei 3MP-5-3

2.8 接种量和装液量对菌株产酶的影响

接种量通过对菌株发酵周期的影响，进而影响菌株酶产量。接种量及装液量对L.casei3MP-5-3生长及产甘露聚糖酶的影响见图8。由图8(a)可见，当接种量为5%时，酶活力最大为63.30±0.52 U·mL-1。随着接种量增加OD值出现显著的下降趋势，可能因为营养物质的消耗菌株之间竞争增大，造成菌株的大量死亡。在确定接种量基础上，通过优化装液量发现，由图8(b)在40～140 mL/250 mL的范围内，随着装液量的逐步增大酶活先升高后下降，在120 mL/250 mL达到最大值64.55±0.20 U·mL-1。

图8 接种量(a)及装液量(b)对L.casei 3MP-5-3生长及产甘露聚糖酶的影响Fig.8 Effects of inoculation (a) and liquid loading (b) on growth and mannanase production of L.casei 3MP-5-3

3 结 论

本文以一株产甘露聚糖酶乳酸菌L.casei3MP-5-3为供试菌株，通过对培养基组分和培养条件的单因素试验优化，实现菌株酶产量的提高。确定了L.casei3MP-5-3最优产酶条件下的培养基各组分为角豆胶6 g·L-1、葡萄糖8 g·L-1、有机氮源中酵母浸粉7 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1，牛肉膏10 g·L-1、柠檬酸铵3 g·L-1、乙酸钠6 g·L-1、吐温80 1 mL、初始pH值5.5。培养条件33 ℃，100 rpm·min-1摇床转速，接种5%的种子液，120 mL/250 mL装液量，酶活达到64.55±0.20 U·mL-1，较优化前的19.93±0.07 U·mL-1提高了2.24倍。此结果不仅提高了甘露聚糖酶产量，也为研究乳酸菌产酶奠定了基础。