碘乙酸钠鼠爪炎性痛模型的建立及TRPV1介导的痛敏机制的研究

南丽婷，吴丹，李莎莎，余双全

(1. 右江民族医学院研究生学院，广西 百色 533000；2. 右江民族医学院基础医学院生理学教研室，广西 百色 533000)

刺激性化学物质注射法是建立炎性痛模型广泛采用的方法之一，其中鼠爪注射引起炎性痛的物质包括福尔马林[1]、角叉菜胶[2]、完全弗式佐剂[3]、蜜蜂毒[4]、松节油[5]等；膝关节部位注射引起炎性痛的物质包括碘乙酸钠(sodium monoiodoacetate，MIA)[6]、木瓜蛋白酶[7]等。鉴于骨关节腔注射碘乙酸钠可成功诱导骨关节炎痛的发生，我们推想，鼠爪注射碘乙酸钠是否能诱导鼠爪产生炎症和炎性痛？如果出现炎症和炎性痛，该痛敏状态持续时间多久？这种炎性痛模型与现有的其他鼠爪炎性痛模型相比有何特点？该炎性痛模型痛敏产生及维持的机制是什么？

瞬时受体电位香草酸亚型1(transient receptor potential vanilloid type 1，TRPV1)是一种非选择性阳离子通道[8]，参与慢性疼痛的发生发展[9-10]。已有报道表明TRPV1介导福尔马林诱导的炎性痛[11]、角叉菜胶诱导的炎性痛[12]、完全弗式佐剂诱导的炎性痛[13]。由此我们提出假设，TRPV1有可能参与介导碘乙酸钠诱导鼠爪部位炎性痛的痛觉过敏。我们将通过给予TRPV1的拮抗剂辣椒平和激动剂辣椒素，研究TRPV1在碘乙酸钠模型痛敏中的作用。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级雄性Wistar大鼠144只，体重210～250 g，购自长沙市天勤生物技术有限公司。动物自由饮食，控制温度23～26 ℃和湿度50%～60%。所有动物实验均遵守相关伦理审批要求。

1.2 试剂 碘乙酸钠(上海联硕生物科技有限公司，批号：64-69-7)，辣椒素(MCE公司，批号：HY-10448)，辣椒平(MCE公司，批号：HY-15640)。

1.3 碘乙酸钠溶液注射创建新型炎症疼痛动物模型 对大鼠使用4%异氟烷诱导麻醉，之后用2%异氟烷维持麻醉，在麻醉状态下给大鼠左后爪足底皮下注射3个浓度的碘乙酸钠溶液，注射体积都是100 μl，注射液中分别含碘乙酸钠0.11 mg、0.33 mg和1 mg。对照组左后爪足底皮下注射100 μl生理盐水。

1.4 动物分组 用于造模实验的大鼠分成低剂量MIA组(MIA 0.11 mg/100 μl)、中剂量MIA组(MIA 0.33 mg/100 μl)、高剂量MIA组(MIA 1 mg/100 μl)和对照组(生理盐水100 μl)等4组，每组8只，共32只。MIA注射方法是大鼠左后爪足底皮下注射MIA。造模实验中每只大鼠均测量其热痛、机械痛、足负重和爪体积。用于辣椒平(capsazepine，CPZ)实验的大鼠分成低剂量CPZ组(MIA 1 mg/100 μl + CPZ 3 μg/100 μl)、中剂量CPZ组(MIA 1 mg/100 μl + CPZ 10 μg/100 μl)、高剂量CPZ组(MIA 1 mg/100 μl + CPZ 30 μg/100 μl)和对照组(MIA 1 mg/100 μl + 生理盐水100 μl)等4组，即3种指标4个剂量，每组8只，共96只。CPZ注射方法是在大鼠左后爪足底皮下注射高剂量碘乙酸钠(1 mg/100 μl)后第2天，大鼠左后爪足底皮下注射CPZ。辣椒平实验使用不同大鼠分别测量其热痛、机械痛、足负重。用于辣椒素实验的大鼠分成碘乙酸钠组(MIA 1 mg/100 μl)和对照组(生理盐水100 μl)等2组，每组8只。辣椒素注射方法是在大鼠左后爪足底皮下注射高剂量碘乙酸钠(1 mg/100 μl)后第2天，大鼠左后爪足底皮下注射辣椒素。

1.5 鼠爪容积测量 造模后第2天用足趾容积测量仪(成都泰盟软件有限公司,型号：PV-200)测量鼠爪容积，3次测量的平均值作为测量值。

1.6 热刺激缩爪潜伏期(paw withdrawal latency to radiant heat)测定 采用足底热辐射测痛仪(Ugo Basile，型号：37370)测量大鼠后爪热刺激缩爪反应潜伏期，反映热痛。将大鼠置于透明观察箱内，大鼠安静后，仪器发射红外光，经玻璃板直接照射大鼠后足底，记录从开始照射至出现逃避性缩爪反应的时间，作为热痛阈(s)。测试前连续3 d适应性训练。测试时，取3次测量(间隔5 min)的平均值作为热痛阈值。

1.7 机械刺激缩爪反射阈值(paw withdrawal threshold to mechanical force)测定 采用动态足底测痛仪(Ugo Basile，型号：37400)测量大鼠后爪机械刺激缩爪反应阈值，反映机械痛。将大鼠置于底部为铁丝网的透明观察箱内，大鼠安静后，用纤丝刺激大鼠后爪足底，刺激强度逐渐增大，记录大鼠出现逃避性缩爪反应的刺激强度，作为机械痛阈(g)。测试前连续3 d适应性训练。测试时，取3次测量(间隔5 min)的平均值作为机械痛阈值。

1.8 足负重试验(dynamic weight bearing) 采用双足平衡测痛仪(成都泰盟，型号：PH-200)测量大鼠足负重，反映自发性疼痛。将大鼠放入黑色有机玻璃测试盒中，大鼠双足分别立在压力传感器面板上。采集大鼠5 s内的左、右足各自承重值。测试前连续3 d适应性训练。测试时，取3次测量(间隔5 min)的平均值，换算成致炎测后肢承重占双后肢全部承重的百分比(足负重值，% weight on ipsilateral hindpaw)。

1.9 辣椒素诱导的保卫性行为(guarding behavior)的观察 大鼠鼠爪足底皮下注射辣椒素(4.5 μg/50 μl)后立即放入透明观察箱中，让其自由活动，记录大鼠5 min内的保卫性行为(持续抬爪、舔爪、快速抬爪放爪)持续时间，大鼠每次快速抬爪放爪换算成抬爪时间0.5 s。

2 结果

2.1 大鼠爪内注射碘乙酸钠产生热痛敏 与对照组(注射生理盐水100 μl)相比，低、中、高剂量碘乙酸钠组的热痛阈值均出现降低，此降低效应呈剂量依赖关系。热痛阈降低在低剂量碘乙酸钠组维持1 d：注射MIA后第1天，低MIA组(5.97±0.41) s vs 对照组(7.05±0.17) s(P<0.05)；热痛阈降低在中剂量碘乙酸钠组维持2 d：注射MIA后第1天和第2天，中MIA组 vs 对照组分别是(3.73±0.54) s vs (7.05±0.17) s和(5.74±0.26) s vs (7.41±0.33) s(P<0.05)；热痛阈降低在高剂量碘乙酸钠组维持5 d：注射MIA后第1天、第2天、第3天、第4天、第5天，高MIA组 vs 对照组分别是(3.36±0.25) s vs (7.05±0.17) s、(3.68±0.23) s vs (7.41±0.33) s、(5.20±0.37) s vs (7.03±0.29) s、(5.32±0.23) s vs (6.91±0.23) s、(6.04±0.41) s vs (7.10±0.18) s(P<0.05)，见图1。

注：MIA指碘乙酸钠，各组动物数=8；与同时间点的对照组相比，*表示P<0.05。

2.2 大鼠爪内注射碘乙酸钠产生机械痛敏 与对照组(注射生理盐水100 μl)相比，低剂量和中剂量碘乙酸钠组的机械痛阈值没有明显变化，但高剂量碘乙酸钠组的机械痛阈值明显降低，这种降低效应长达4 d：注射MIA后第1天、第2天、第3天、第4天，高MIA组 vs 对照组分别是(15.09±0.66) g vs (25.72±1.77) g、(12.80±0.93) g vs (25.30±1.34) g、(16.40±1.14) g vs (26.22±0.86) g、(17.13±1.30) g vs (26.27±1.11) g(P<0.05)，见图2。

注：MIA指碘乙酸钠，各组动物数=8；与同时间点的对照组相比，*表示P<0.05。

2.3 大鼠爪内注射碘乙酸钠降低足负重 与对照组(注射生理盐水100 μl)相比，低、中、高剂量碘乙酸钠组的足负重均出现降低。此降低效应在低剂量和中剂量碘乙酸钠组皆维持1 d：注射MIA后第1天，低MIA组(43.92±3.43)% vs 对照组(50.88±0.79)%，中MIA组(43.73±2.45)% vs 对照组(50.88±0.79)%(P<0.05)；此降低效应在高剂量碘乙酸钠组维持6 d：注射MIA后第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天，高MIA组 vs 对照组分别是(36.85±2.60)% vs (50.88±0.79)%、(33.13±1.98)% vs (50.03±0.25%)、(39.60±2.51)% vs (50.33±0.40)%、(42.85±1.83)% vs (50.07±0.51)%、(43.25±1.81)% vs (50.09±0.33)%、(44.64±1.27)% vs (50.09±0.24)%(P<0.05)，见图3。

注：MIA指碘乙酸钠，各组动物数=8；与同时间点的对照组相比，*表示P<0.05。

2.4 大鼠爪内注射碘乙酸钠增加爪体积 与对照组(注射生理盐水100 μl)相比，高剂量碘乙酸钠组(MIA剂量是 1 mg/100 μl)大鼠鼠爪体积增加明显：注射MIA后第2天，高MIA组(2.55±0.07)ml vs 对照组(1.56±0.03) ml(P<0.05)，见图4。

注：MIA指碘乙酸钠，各组动物数=8；与对照组相比，*表示P<0.05。

2.5 辣椒平可反转碘乙酸钠诱导的热痛阈值降低 注射高剂量碘乙酸钠(1 mg/100 μl)后第2天，爪内注射TRPV1受体特异性拮抗剂辣椒平(capsazepine，CPZ，低剂量、中剂量、高剂量分别是3 μg/100 μl、10 μg/100 μl、30 μg/100 μl)，产生长达1 h以上的热痛镇痛效应，且此效应呈现剂量依赖关系。与对照组(生理盐水，NS，100 μl)相比，高剂量辣椒平组对碘乙酸钠诱导的热痛的反转作用最为明显：注射CPZ后第10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，高CPZ组vs NS组分别是(5.68±0.55) s vs (3.31±0.24) s、(6.05±0.60) s vs (3.38±0.20) s、(5.45±0.41) s vs (3.80±0.44) s、(5.41±0.44) s vs (3.03±0.25) s、(5.21±0.42) s vs (3.28±0.15) s、(4.92±0.30) s vs (3.39±0.28) s(P<0.05)，见图5。

注：CPZ指辣椒平，各组动物数=8；与同时间点的对照组相比，*表示P<0.05。

2.6 辣椒平可反转碘乙酸钠诱导的机械痛阈值降低 注射高剂量碘乙酸钠(1 mg/100 μl)后第2天，爪内注射TRPV1受体特异性拮抗剂辣椒平(低、中、高剂量分别是3 μg/100 μl、10 μg/100 μl、30 μg/100 μl)，产生持续20 min左右的机械痛镇痛效应，且此效应呈现剂量依赖关系。与对照组(生理盐水，NS，100 μl)相比，高剂量辣椒平组对碘乙酸钠诱导的机械痛的反转作用最为明显：注射CPZ后第20 min、30 min、40 min，高CPZ组vs NS组分别是(22.63±1.49) g vs (14.70±2.08) g、(22.66±1.97) g vs (14.52±1.40) g、(23.98±0.89) g vs (14.38±2.65) g(P<0.05)，见图6。

注：CPZ指辣椒平，各组动物数=8；与同时间点的对照组相比，*表示P<0.05。

2.7 辣椒平可反转碘乙酸钠诱导的足负重降低 注射高剂量碘乙酸钠(1 mg/100 μl)后第2天，爪内注射TRPV1受体特异性拮抗剂辣椒平(低剂量、中剂量、高剂量分别是3 μg/100 μl、10 μg/100 μl、30 μg/100 μl)，足负重出现加重，且此效应呈现剂量依赖关系。与对照组(生理盐水，NS，100 μl)相比，低剂量辣椒平不改变碘乙酸钠诱导的足负重降低；中剂量辣椒平对碘乙酸钠诱导的足负重降低产生短暂的缓解作用：注射CPZ后第20 min，中CPZ组(40.39±2.11)% vs NS组(32.44±3.03)% (P<0.05)；高剂量辣椒平对碘乙酸钠诱导的足负重降低产生明显的反转作用：注射CPZ后第10 min、20 min、30 min、40 min、50 min，高CPZ组vs NS组分别是(42.02±2.83)%vs (30.96±2.85)%、(43.95±2.75)% vs (32.44±3.03)%、(44.88±2.72)% vs (34.58±2.58)%、(45.47±2.84)% vs (34.91±1.93)%、(39.93±1.75)% vs (33.57±1.43)%(P<0.05)，见图7。

注：CPZ指辣椒平，各组动物数=8；与同时间点的对照组相比，*表示P<0.05。

2.8 辣椒素对碘乙酸钠炎性痛大鼠保卫性行为的影响 鼠爪注射TRPV1激动剂辣椒素(4.5 μg/50 μl)后，碘乙酸钠组(1 mg/100 μl)大鼠保卫性行为(抬爪、舔爪)累计时间显著高于对照组：MIA组 vs 对照组(130.38±14.09) s vs(48.00±8.35) s(P<0.05)，见图8。

注：MIA指碘乙酸钠，各组动物数=8；与对照组相比，*表示P<0.05。

3 讨论

本次研究表明碘乙酸钠鼠爪注射可产生长达5 d的热痛、长达4 d的机械痛和长达6 d的自发痛；碘乙酸钠注射后，鼠爪变得肿胀；辣椒平有效缓解碘乙酸钠诱导的热痛、机械痛和自发痛；辣椒素刺激后，碘乙酸钠炎性痛大鼠的疼痛行为明显增加。

不同时程的炎性痛模型可分别用来研究临床上相对应的不同时程的慢性痛。目前鼠爪部位注射化学物质诱导的慢性炎性痛模型中，痛敏状态持续一两天的短程慢性炎性痛模型有蜜蜂毒模型[14]，痛敏状态持续1周左右的中程慢性炎性痛模型有松节油模型[5]，痛敏状态持续两周以上的长程慢性炎性痛模型有完全弗式佐剂模型[3]。本实验通过鼠爪注射碘乙酸钠，观察到持续4～6 d的热痛过敏、机械痛过敏和自发痛，从而在痛敏时程位于一周左右的中程慢性炎性痛动物模型中增加了一种新型的鼠爪炎性痛模型。

这种新型鼠爪炎性痛模型的痛敏程度显著：热痛阈值降低50%，机械痛阈值降低49%，足负重降低至33%；与之比较，同属中程慢性炎性痛的松节油炎性痛模型的热痛阈值降低55%[5]，机械痛阈值降低78%[5]，足负重降低至24%[15]。可以看出，碘乙酸钠鼠爪炎性痛模型在疼痛时程、疼痛程度方面可以比拟现有的慢性炎性痛模型。不仅如此，由于碘乙酸钠来源方便，使得该模型具有经济实用的优势。这个新型模型将为慢性疼痛的研究在慢性动物炎性痛模型的选择方面增加一个选项。接下来我们探讨碘乙酸钠鼠爪炎性痛的痛敏机制。TRPV1是一种在初级感觉神经元中大量表达的阳离子通道[11]，有报道揭示TRPV1介导福尔马林诱导的炎性痛、角叉菜胶诱导的炎性痛[12]、完全弗式佐剂诱导的炎性痛[13]。TRPV1是否也介导碘乙酸钠鼠爪炎性痛？我们从拮抗和激活TRPV1两个方面去了解TRPV1在碘乙酸钠鼠爪炎性痛中的作用。在碘乙酸钠炎性痛大鼠鼠爪部位注射TRPV1拮抗剂辣椒平后，无论是诱发痛(热痛敏、机械痛敏)还是自发痛(足负重)都得到缓解，这些结果提示TRPV1参与了碘乙酸钠诱导的诱发痛和自发痛。碘乙酸钠炎性痛大鼠鼠爪部位给予TRPV1激动剂辣椒素后，注射侧大鼠鼠爪产生了更多的痛觉行为(即以抬爪舔爪为特征的保卫性行为，表现为抬爪时间明显增多)，这种加剧的TRPV1激动反应提示TRPV1表达水平在碘乙酸钠注射大鼠鼠爪后可能发生上调，而TRPV1的上调则暗示TRPV1在碘乙酸钠诱导的炎性痛的发生发展中起重要作用。以上结果提示碘乙酸钠诱导的痛觉过敏至少部分是由TRPV1介导的。

总之，通过鼠爪注射碘乙酸钠可以成功建立一种新型中程慢性炎性痛模型，这种模型为慢性疼痛研究领域提供了一种造模简单、经济实用的实验动物模型。碘乙酸钠鼠爪炎性痛的发生发展至少部分是由TRPV1介导的。