Ki-67表达及四种分子分型对髓母细胞瘤患者预后的危险分级

李亚明 刘献志

郑州大学第一附属医院，河南 郑州 450052

髓母细胞瘤（medulloblastoma，MB）是儿童最常见、多发生在颅内小脑的中枢神经系统、原发性的高度恶性的肿瘤［1-2］。未进行手术结合放化疗的患者的3～5 a 的无进展生存率（event-free survival，EFS）较低［3］。最近研究发现肿瘤标志物对MB 患者的预后有影响，这些标志物可能成为治疗MB 新的靶点。Ki-67是增殖细胞的细胞核抗原，作为其中的一种增殖标志物，广泛表达在细胞周期的所有阶段及有丝分裂的细胞核中［4］。Ki-67 的免疫组化（IHC）染色被用于评价更具侵袭性的表型的鉴别。Ki-67 增殖指数在多种类型的癌症中也成为了重要的预后指标［5］。Wingless（WNT）、Sonic Hedgehog（SHH）、GROUP 3和GROUP 4 亚型为MB 的四分型，由于四分型具有不同的细胞遗传学特征、遗传畸变、基因表达谱，因此其预后也不相同［6］。目前国内无Ki-67 表达及MB四分型对MB 患者预后进行分级的相关文献报道。本研究旨在探讨Ki-67表达及MB四分型对患者的预后危险分级是否可能是MB 患者中一个潜在的独立预后危险因素，为MB的临床治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料入组2009-01—2018-01 于郑州大学第一附属医院经手术切除治疗且术后病理报告结果为MB，同时行免疫组化Ki-67 检测的92 例患者。所有入选患者均享有本研究知情同意权，并亲笔签署知情同意书。该研究资料收集遵守《赫尔辛基宣言》的规定。本研究设计通过郑州大学第一附属医院伦理委员会的审核、批准（2019-KY-176）。

1.2 纳入标准（1）术前检查均显示无明显手术禁忌证；（2）术后病理结果证实为MB并行Ki-67和四分型检测。排除临床资料不完整者。

1.3 Ki-67检测选取92例MB患者的肿瘤组织，经10%甲醛固定后，常规石蜡包埋组织，选取最大面积处切片（厚度＜4 μm）。按照免疫组化操作流程操作。Ki-67 兔抗人（北京中杉）。设置质控片：采用Ki-67明确表达阳性的切片做为阳性对照，阴性对照设置PBS代替一抗。

1.4 四分型检测92 例MB 患者的肿瘤组织通过10%的福尔马林固定及石蜡包埋（FFPE）组织。从FFPE 组织中提取RNA，然后根据NORTHCOTT 等［7］描述的方法，采用基于NanoString的检测方法检测肿瘤样本的四分型。WNT、SHH、GROUP 3和GROUP 4亚型按CodeSet进行分类，CodeSet由22个基因组成，每个亚型中有5～6个特征基因：WNT：DKK2、EMX2、GAD1、TNC、WIF1，SHH：ATOH1、EYA1、HHIP、PDLIM3、SFRP1，GROUP 3：EGFL11、GABRA5、IMPG2、MAB21L2、NPR3、NRL，GROUP 4：EOMES、KCNA1、KHDRBS2、OAS1、RBM24、UNC5D。

1.5 随访电话或门诊收集获得随访资料。查阅临床病案系统且从中归纳收集患者临床资料，其中包括：性别、年龄、术前生存质量评分（Karnofsky Performance Status，KPS）、切除程度、放疗及化疗等信息。总生存期（Overall Survival，OS）代表手术与死亡或随访结束之间的间隔时间，无进展生存期（Progression-free survival，PFS）是指从诊断之日到疾病进展复发、死亡或最后随访的日期之间的间隔时间。

1.6 统计学方法选用SPSS 22.0 软件对研究数据行统计学分析。选用Kaplan-Meier 生存曲线计算统计分析OS、PFS 的生存率，Log-rank 统计采用单因素生存分析比较，Cox比例风险模型评估采用多因素分析比较。设定检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 影响MB患者预后的单因素分析单因素分析结果显示，年龄、切除程度、放疗、化疗均为影响MB患者预后的因素。见表1。

2.2 Ki-67 和MB 四分型对患者预后的影响根据文献报道［1］，本文选取Ki-67 等于50%为临界值做预后的生存分析，92 例患者中，Ki-67≤50% 50 例（54.3%），5 a PFS及OS分别为46.9%、63.1%；Ki-67＞50% 42 例（45.7%），5 a PFS 及OS 分别为28.5%、32.0%。两者PFS 和OS 比较差异均有统计学意义（P=0.020，P=0.028）。见表1、图1。92 例患者中WNT、SHH、GROUP 3 和GROUP 4 亚型分别为16 例（17.4%）、14 例（15.2%）、40 例（43.5%）和22 例（23.9%），5 a PFS和OS分别为78.0%、76.0%、19.2%、19.9%和82.1%、76.0%、40.2%、0%。见表1。PFS 和OS 差异均有统计学意义（P=0.003，P=0.039）。见图1C、1D。

图1 髓母细胞瘤患者Ki-67表达和四分型与髓母细胞瘤患者预后的关系Figure 1 The relationship between Ki-67 expression and tetratype in medulloblastoma patients and prognosis of medulloblastoma patients

表1 影响髓母细胞瘤患者预后因素的单因素分析Table 1 Univariate analysis of prognostic factors in patients with medulloblastoma

2.3 Ki-67表达和四分型对MB 患者预后危险分级根据Ki-67 表达和四分型对MB 患者预后有影响，将同时满足Ki-67≤50%、WNT 和SHH 亚型MB 患者划分为低危组（Low risk group，n=12），同时满足Ki-67≤50%、GROUP 3 和GROUP 4 亚型及Ki-67＞50%、WNT 和SHH 亚型MB 患者划分为中危组（Intermediate risk group，n=56），将Ki-67＞50%、GROUP 3 和GROUP 4 亚型MB 患者划分为高危组（High risk group，n=24）。低、中和高危组MB患者的预后差异有统计学意义（PFS，P＜0.001，OS，P＜0.001）。见图2。

图2 髓母细胞瘤患者预后危险分组对预后的影响Figure 2 The effect of prognostic risk grouping on prognosis in patients with medulloblastoma

2.4 影响髓母细胞瘤患者预后因素的多因素分析将对MB患者预后有影响的因素纳入多因素Cox 比例风险模型评估，结果显示未进行放疗、危险分级为MB患者预后的独立危险因素。

3 讨论

世界卫生组织（WHO）2016［8］和2021版［9］对中枢神经系统肿瘤的分类进行了总结，从中可以发现WNT，SHH，GROUP 3 和GROUP 4 亚型是被广泛接受的MB 的基因分型，应被广泛应用到MB 的临床分子病理诊断中。此外，有研究表明［10-12］，WNT亚型患者长期生存率超过90%，预后最好，PHOENIX［13］等研究阐述了与其他亚型相比，WNT 亚型即使发生转移也可以治愈，其发现WNT亚型MB缺乏功能性的血-

脑屏障（blood barain barrier，BBB），这有利于全身化疗进入WNT 亚型肿瘤，有利于WNT 亚型MB 的治疗，与此同时，BBB的破坏是由肿瘤分泌的WNT拮抗剂阻断了邻近内皮细胞的旁分泌WNT 信号的正常过程，这种信号诱导了血管和屏障生成，并在整个生命中维持了BBB。因此，抑制WNT以破坏BBB并改善化疗效果是一种机制［14-15］。SHH 亚型MB 是以Sonic Hedgehog信号通路命名的，该通路被认为在很多此类病例中促进肿瘤的发生［10］。研究表明针对平滑蛋白（SMO）的小分子对SHH 亚型MB 暂时非常有效，突出了开发有效和实用的SHH 亚型MB 标志物和靶向治疗的前景［10，12，16-20］。由于本研究对其余两个亚型的生物学知识了解较少，因此共识是在这些亚型的基本生物学知识得到更好的界定之前，暂时保留通用名称［10］。总之，分子分型不仅有助于确定有些药物（SHH 抑制剂）的目标队列，还能大大增加诊断时的结果预测，具有广泛的临床应用价值和前景。Ki-67 作为一种增殖标志物，在本文中Ki-67 的增高预示MB 患者预后差，且Ki-67 被广泛应用于肿瘤分子病理的诊断，本文对MB 诊断时结果的预测、患者个体化治疗以及相关靶向药物的开发都具有指导意义。目前笔者针对现有的肿瘤标本，只进行了四分型和Ki-67的测定。

目前，髓母细胞瘤患者的治疗仍是以手术切除为主，辅助放化疗的综合治疗方法。国内仍根据患者年龄、手术切除程度、有/无转移和病理类型对MB患者进行危险程度分级［21-24］：标危组（年龄＞3 岁儿童MB）：肿瘤完全切除或近完全切除（残留病灶≤1.5 cm2），无扩散转移；高危组（年龄＞3岁儿童MB）：手术次全切除（残留病灶＞1.5 cm2）；伴有转移性疾病（包括神经影像学播散性疾病，手术14 d后腰穿或脑室脑脊液阳性细胞学证据或颅外转移；病理类型为弥漫间变型）。标危组（年龄≤3岁儿童MB）：同时符合肿瘤完全切除或近完全切除（残留病灶≤1.5 cm2）、无扩散转移、病理类型为促结缔组织增生型和广泛结节性；高危组（年龄≤3 岁儿童MB）：除标危外。2015 年RAMASWAMY 等［25］结合分子分型重新定义儿童（3～17岁）MB危险分级。根据预后5 a生存率分为4组：（1）低危组（＞90%）：无扩散转移的WNT 型、无扩散转移和伴染色体11 的缺失或染色体17 获得的GROUP 4；（2）标危组（75%～90%）：无扩散转移、不伴TP53 突变和无MYCN 扩增的SHH，无扩散转移和MYC 扩增的GROUP 3 型，无扩散转移和不伴染色体11缺失的GROUP 4型；（3）高危组（50%～75%）：伴有转移的SHH 或GROUP 4，MYCN 扩增的SHH；（4）超高危组（＜50%）：伴有转移的GROUP 3和TP53突变的SHH。国内有文献对此进行了报道［19］，但尚无根据分子分型对MB进行危险分级的相关研究。

表2 影响髓母细胞瘤患者预后因素的多因素分析Table 2 Multivariate analysis of prognostic factors in patients with medulloblastoma

Ki-67作为一个近核仁区且相对分子量为35 000的核抗原，能标记细胞周期的除G0期外的G1、S、G2和M期细胞核，其表达量也随细胞周期逐渐增加［26］。Ki-67能够快速识别处于增殖分裂期的细胞，可以评估肿瘤细胞的增殖活性，其表达量的高低与肿瘤恶性程度和生存期等密切相关［27-29］。Ki-67 表达量的增加，预示着MB患者预后较差［4］。本研究也再次证实了在MB患者中Ki-67≤50%较Ki-67＞50%的预后好。

本研究证实Ki-67≤50%的MB 患者较Ki-67＞50%的患者预后好，以及四分型MB 患者预后的不同。本文将同时满足Ki-67≤50%和WNT、SHH亚型MB 患者分为低度危险组；满足Ki-67≤50%和GROUP 3、GROUP 4 亚型以及Ki-67＞50%和WNT，SHH亚型的MB患者分为中度危险组；最后将Ki-67＞50%和GROUP 3、GROUP 4亚型的MB患者分为高度危险组。3组患者的预后具有明显的差异，且危险分组为影响MB患者预后因素的独立危险因素。同时，本研究也存在一些不足，未进行染色体1q、7 和17q的扩增，以及染色体8、染色体11和染色体17p缺失、TP53 突变、MYCN 和MYC 扩增等的检测，另外，需要多中心的研究。本研究也提示在今后的临床治疗工作中，对MB 患者采取规范化、标准化综合治疗的同时，更应严格采取对不同危险分级的MB患者选择不同规范化的综合治疗策略，以望能够提高MB患者的生存率。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。