胶质瘤中真核生物翻译起始因子4A1的生物信息学分析

廖园园 徐 俊 熊尚峰 蔡崇明 田春苗 易仁辉

1）赣南医学院第一附属医院，江西 赣州 341000 2）瑞金市人民医院，江西 瑞金 342500

胶质瘤是中枢神经系统（central nervous system，CNS）最常见的肿瘤，约占所有CNS肿瘤的27%，占恶性肿瘤的80%，大部分呈弥漫性生长［1-3］。近年来，尽管包括手术切除、替莫挫胺同步放疗联合化疗的强化多元化治疗管理策略提高了胶质瘤患者的生存率，但中远期预后仍较差［4-5］。因此，进一步研究胶质瘤的起始、进展和预后相关的分子生物学事件具有重大意义，将可能为胶质瘤的诊疗提供新的思路和理论依据。

真核生物翻译起始因子4A1（eukaryotic translation initiation factor 4A1，EIF4A1）蛋白属于胞质蛋白，主要参与蛋白质翻译起始阶段对核糖体的募集等［6-7］。EIF4A1 基因在肝癌、宫颈癌、胃癌和结肠癌等类型肿瘤中的作用已有部分研究［6-9］，然而，在胶质瘤中EIF4A1 的作用及机制却鲜有研究。本研究基于癌症基因组图谱研究网络（The Cancer Genome Atlas Research Network，TCGA）数据库中具有完整临床病理及随访资料的胶质瘤和正常脑组织病例的资料数据，分析EIF4A1基因在脑胶质瘤中的表达状态及肿瘤进展与患者预后的相关性，为研究EIF4A1在胶质瘤进展中的作用和机制研究提供新的思路和理论依据。

1 材料与方法

1.1 数据采集及预处理从TCGA 数据库（http://cancergenome.nih.gov）中收集并提取胶质瘤和正常脑组织病例最新的mRNA Seq 基因测序分析数据及对应的临床病理资料数据。排除临床、病理或随访资料缺失或不完整的病例，共收集609例胶质瘤和5例正常脑组织病例样本数据。其中，低级别胶质瘤（low-grade gliomas，LGG）216 例,高级别胶质瘤（high-grade gliomas，HGG）393 例。609 例胶质瘤病例中男354 例，女255 例；年龄14～89 岁（52.27 ±15.06）。所有胶质瘤病例均有完整的临床、病理及随访资料，随访时间3～6 330 d。

1.2 基因表达特点分析应用609例胶质瘤组织和5例正常脑组织的EIF4A1基因表达数据进行差异表达特点分析，探讨EIF4A1在正常组织和肿瘤组织中的差异表达。将EIF4A1 基因表达数据分成低级别胶质瘤组及高级别胶质瘤组，分析EIF4A1基因表达水平与胶质瘤恶性程度的相关性。同时，通过对收集的胶质瘤病例对应的KI-67 表达水平进行配对差异表达分析。

1.3 分析基因表达状态与胶质瘤的临床病理特征之间的相关性为了分析EIF4A1 基因表达与患者的临床病理特征之间的相关性，根据EIF4A1表达量的均值，将EIF4A1 基因表达分为低表达组（＜12.86）和高表达组（≥12.86），并与患者的病理特征，如年龄（分为＜50岁和≥50岁）、性别（分为男、女）、病理类型（星型细胞瘤、少突胶质细胞瘤、其他）、临床WHO分级（Ⅰ～Ⅱ、Ⅲ～Ⅳ级）、KI-67表达状况（高表达和低表达）及IDH 突变情况（突变型和野生型）等因素进行统计分析。

1.4 单因素及多因素分析根据胶质瘤患者的相关临床病理参数，如患者的年龄、性别、临床WHO 分级、组织病理类别、EIF4A1表达状况、KI-67表达状况等因素，带入Cox 模型后，计算各临床病理特征的P值、HR 和95% CI。先进行单因素分析，再进行多因素分析。

1.5 生存分析根据患者的EIF4A1不同表达状态，应用Kaplan-Meier 生存分析方法对胶质瘤患者进行分析，明确EIF4A1高表达与低表达患者的总体生存时间是否有差异。

1.6 统计学分析所有研究结果均用SPSS 21.0 软件统计分析，应用χ2检验分析组间差异或相互关系，分组表达状态之间的生存分析采用Kaplan-Meier法，组间比较采用Log-Rank 检验，多因素分析采用Cox回归多因素模型，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EIF4A1 基因在胶质瘤中呈高表达状态EIF4A1的mRNA表达水平在胶质瘤中明显高于正常脑组织，差异有统计学意义（P＜0.000 1，图1A），低级别胶质瘤的表达水平低于高级别胶质瘤，差异有统计学意义（P＜0.000 1，图1B）。通过对收集胶质瘤病例对应的KI-67 表达量分析后发现，胶质瘤组织中EIF4A1 mRNA 表达水平与KI-67 的表达水平呈正相关，差异有统计学意义（r=0.423 9，P＜0.000 1，图2）。

图1 A：TCGA数据库中EIF4A1 mRNA在胶质瘤及正常脑组织中的表达情况；B：EIF4A1 mRNA在低级别胶质瘤及高级别胶质瘤中的表达情况Figure 1 A：Expression of EIF4A1 mRNA in glioma and normal brain tissue，TCGA datasets were used for the analysis；B：EIF4A1 mRNA expression in the low-grade glioma and high-grade glioma

图2 胶质瘤组织中EIF4A1与KI-67基因表达水平的相关性Figure 2 Correlation between EIF4A1 and KI-67 expression levels in glioma

2.2 EIF4A1 基因表达水平与胶质瘤的临床病理特征之间的相关性 EIF4A1 mRNA表达状态与患者年龄、病理类型、WHO分级、KI-67表达状态及IDH突变情况密切相关（P＜0.001），而与病人的性别及1p/19q缺失情况无明显相关性。≥50 岁病例中EIF4A1 mRNA 高表达率为58.9%，以高表达为主；＜50 岁中EIF4A1 mRNA低表达率为56.3%，以低表达为主。EIF4A1 mRNA在胶质瘤病理类型中有不同的表达，星型细胞瘤及少突胶质细胞瘤以低表达为主（分别为74.5%、64.1%），其他类型以高表达为主（57.4%）。临床WHO 分级中EIF4A1 表达也不同，其中低级别胶质瘤以低表达为主（68.5%），高级别以高表达为主（60.8%）。IDH突变情况中，突变型以低表达为主（56.1%），野生型以高表达为主（60.9%）。见表1。

表1 胶质瘤中EIF4A1基因表达与临床病理特征之间的相关性分析Table 1 Correlation between EIF4A1 expression and clinicopathological characteristics in glioma

2.3 EIF4A1 基因的表达状态与胶质瘤患者生存预后的关系Kaplan-Meier 生存分析显示，以EIF4A1 mRNA 表达量的均值为分界，EIF4A1 mRNA 表达与胶质瘤患者生存时间呈负相关，EIF4A1 mRNA 低表达病例生存时间明显长于高表达病例，差异有统计学意义（P＜0.001，图3）。

图3 EIF4A1表达状态与胶质瘤患者生存期之间的关系Figure 3 The relationship between EIF4A1 expression status and survival of patients with glioma

2.4 单因素及多因素Cox回归分析将患者的性别（分为男、女）、年龄（分为＜50岁和≥50岁）、病理类型（星型细胞瘤、少突胶质细胞瘤、其他）、临床WHO 分级（Ⅰ～Ⅱ、Ⅲ～Ⅳ级）、EIF4A1 表达状况（高表达和低表达），KI-67 表达状况（高表达和低表达）、生存时间及结局进行单因素Cox 回归分析，结果显示，年龄（P＜0.001，HR=0.202）、病理类型（P=0.001，HR=0.132）、WHO 分级（P＜0.001，HR=0.164）、EIF4A1 表达状态（P=0.001，HR=0.600）和KI-67 表达状态（P＜0.001，HR=0.319）与患者生存预后明显相关，性别（P=0.997，HR=0.997）与胶质瘤患者生存时间的关系差异无统计学意义。进一步多因素分析显示，年龄（P＜0.001，HR=4.054）、WHO 分级（P=0.010，HR=2.721）和KI-67 表达状态（P=0.001，HR=1.907）与生存预后明显相关；病理类型（P=0.217，HR=1.568）和EIF4A1 表达状态（P=0.973，HR=1.006）与胶质瘤患者生存时间的关系差异无统计学意义。见表2。

表2 胶质瘤患者预后的Cox单因素及多因素回归分析Table 2 Univariate and multivariate Cox regression analysis of overall survival duration in patients with glioma

3 讨论

胶质瘤发生于神经外胚层，具有胶质细胞表型特征，是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤［1-4］。美国癌症学会2014 年癌症统计的报告指出，胶质瘤新发病例仍在世界范围内快速增长［3］。根据最新的2015版中国中枢神经系统胶质瘤诊断与治疗指南及2016版美国国家综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）中枢神经系统肿瘤指南，胶质瘤分为WHO Ⅰ～Ⅳ级，包括低增殖性、低浸润性的胶质瘤（Ⅰ～Ⅱ级），间变型胶质瘤（Ⅲ级），高浸润性、有坏死倾向的胶质母细胞瘤（Ⅳ级）等。其中，WHO Ⅰ～Ⅱ为低级别胶质瘤（low-grade gliomas，LGG），WHO Ⅲ～Ⅳ为高级别胶质瘤（high-grade gliomas，HGG）［3-5］。成人高级别胶质瘤的1 年及5 年生存率分别约为30%和13%，特别是胶质母细胞瘤患者的5年生存率只有3%～5%［3，10-12］。

胶质瘤的发病机制非常复杂，目前可确定的危险因素包括电离辐射、环境因素、遗传易感性等［13-15］。近几年，对于胶质瘤发病机制研究的热点主要是相关基因的表达抑制或失调，如EGFR、RTK和mTOR等［16-19］。其中，一些生物学分子标记物对确定分子亚型、指导个性化诊疗以及临床判断预后具有十分重要的意义，如异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenases，IDH）突变主要见于70%～80% WHO Ⅱ～Ⅲ级的侵袭性胶质瘤和继发性胶质母细胞瘤中，年龄在55 岁以上的大部分IDH野生型患者中位生存期比IDH突变的患者更短，而肿瘤侵袭性则更强［20-21］；内源性O6-甲基鸟嘌呤-DNA（MGMT）启动子区甲基化水平可预测胶质母细胞瘤的预后［22-23］；1p/19q 联合缺失的患者总体生存时间更长，对化疗的敏感性更高，治疗效果更佳［24-25］；KI-67是一种细胞增殖核抗原，可用于判断胶质瘤的细胞增殖活性等［26-28］。

EIF4A1是真核生物细胞内真核翻译起始因子的重要类型，具有ATP依赖性RNA解旋酶活性和RNA依赖性ATP 酶活性，主要作用是参与蛋白质翻译起始阶段对核糖体的募集。研究发现，在部分肿瘤中，包括EIF4A1 在内的很多翻译起始因子的基因表达水平发生改变，最终导致基因翻译起始失控，进而引起癌症的发生和发展［29］。EIF4A1在肝癌、乳腺癌、胃癌和结肠癌等肿瘤中起促癌基因的作用［6-9，30］，因此推测EIF4A1 的表达状态可能在肿瘤的发生发展中有重要作用。然而，在人脑胶质瘤中，2019年张俊文等［31］仅在细胞水平对EIF4A1 对肿瘤增殖的侵移能力进行了阐述。

本研究通过对差异表达的基因进行分析后发现，EIF4A1 基因在胶质瘤组织中高表达，且与高龄、胶质瘤恶性程度及KI-67的表达是显著正相关，提示EIF4A1 在胶质瘤中可能起候选促癌基因作用，并可能与肿瘤细胞的增殖活性有关。Kaplan-Meier 生存分析及Cox 回归单因素分析结果显示，EIF4A1 基因的表达与胶质瘤患者生存预后显著相关，EIF4A1 高表达是胶质瘤疾病进展和预后不良的潜在不良因素。本研究将可能为胶质瘤的诊疗在新的深层次的发病机制和分子病理学研究方面提供理论基础。

随着胶质瘤分子生物学研究的不断推进，对胶质瘤发生发展机制有了更深的的理解，一部分用于病理分型及诊断、预后相关的标志物被确认，目前已应用于基础实验及临床。尽管胶质瘤的疾病进展与预后相关的标志基因研究与人们的期望仍存在一定的距离，但随着人们对胶质瘤发病机制及相关基因研究的不断深入，以及细胞和分子生物学技术的不断更新，将会出现更多更优化的标志基因应用于临床，为胶质瘤患者的诊断、治疗策略的选择以及预后的评估等方面服务。