体外膜肺氧合全血离体灌注边缘性供肝功能的实验研究
2022-07-02季学闻马利兵若巴提艾尔肯肉斯太木江依马木赵晋明
季学闻,马利兵,若巴提·艾尔肯,肉斯太木江·依马木,赵晋明
(新疆医科大学第一附属医院肝脏·腹腔镜外科,乌鲁木齐 830054)
心脏性死亡器官捐献(Donation after cardiac death,DCD)供体在心脏停跳过程中,其肝脏会经历低血压、休克、缺氧等热缺血损伤,导致供肝的质量和功能异常,成为边缘性供肝(Marginal donor liver),其利用率在美国仅为2%~14%,造成的主要原因是热缺血时间过长[1]。体外膜肺氧合技术(Extracorporeal membrane oxygenation, ECMO)可将血液从体内引到体外,经膜肺氧合再用泵将血灌入体内,实现在心脏停跳后即刻提供稳定的自体血流灌注和充分的氧供,可进行长时间心肺支持,有效减少器官热缺血时间[2]。研究表明,对心脏性死亡器官捐献供体进行ECMO 在体常温灌注,使器官获取和使用率均明显提高,肝移植术后受体1 年生存率达80%~90%,移植肝和受体的存活率与同期接受标准化脑死亡器官捐献(Donation after brain death,DBD)供体的存活率相当[3]。本实验探讨体外ECMO技术对提高边缘性供肝功能的可行性,现报道如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料与分组选择健康比格犬6 只,体重11~13 kg,雌雄不限,由新疆医科大学第一附属医院动物中心提供。所有动物实验遵从动物福利,实验方案通过实验动物伦理委员会审查(IACUC-20160218-018)。将实验犬编为1~6 号,按数字表法随机分为实验组和对照组,各3 只。HE 染色用肿瘤坏死因子(TNF-α)试剂盒(美国Biovision 公司)。体外循环机及配套ECMO 套包(德国STOCKO 公司,STOCKERT Instr.MunichⅡ型)。
1.2 方法所有动物实验前禁食、禁水6 h,腹腔注射2.5%戊巴比妥钠(1.0 mL/kg)。麻醉成功后,两组全身肝素化,取腹部大十字切口,游离腹主动脉腹腔段和肝动脉及门静脉,完整取出肝脏,常温下离体热缺血20 min,对照组犬肝脏采用800 mL,0~4℃组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐(HTK)器官保存液灌注并冷保存2 h;实验组犬肝脏采用ECMO 转流,常温下全血离体连续灌注2 h,用800 mL 0~4℃HTK器官保存液灌注并冷保存2 h。ECMO 管路在实验组热缺血期按静脉-动脉(V-A)ECMO 辅助安装方式:即经肝动脉和门静脉插管建立ECMO输出管,肝下下腔静脉插管建立ECMO 输入管,插管型号根据犬血管直径而定;离体辅助灌注期间流量范围在40~220 mL·kg-1·min-1,静脉血氧饱和度维持在65%以上,ECMO 管路浸入水温为37℃的恒温箱中。抗凝血策略:持续静脉泵入肝素,维持激活全血凝固时间(ACT)180~220 s,观察ECMO环路血栓情况。收集两组犬全身血液用于EC⁃MO的全血体外转流。
1.3 观察指标
1.3.1 HE 染色的组织学特征 取两组犬肝组织用10%中性福尔马林固定,石蜡包埋,苏木精-伊红染色,4 μm 切片,光学显微镜下观察。采用改良Suzuki评分标准评估两组犬肝组织缺血再灌注损伤的严重程度(充血、空泡化、细胞浸润和坏死)[4]。
1.3.2 透射电镜下的组织学特征两组犬肝组织环氧树脂包埋,70 nm 切片,饱和醋酸铀、构椽酸铅双重染色,透射电镜观察两组犬肝细胞核、线粒体及内质网超微结构的变化,放大倍数为24 000倍。
1.3.3 肝组织内TNF-α 表达的H-Score 评分两组犬肝组织标本用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,常规5 μm连续切片,用免疫组化SABC 法,加入PBS,按1∶100配好的一抗(Bioss 公司的兔抗肿瘤坏死因子),置于湿盒内4℃孵育过夜。PBS(pH 7.4)洗涤3 次,每次5 min。加入二抗(Servicebio公司HRP标记的山羊抗兔IgG),室温孵育50 min,DAB显色液和苏木素染色,脱水封片。采用Pannoramic MIDI 数字切片扫描仪(匈牙利,3D HISTECH 公司)扫描,Pannoramic viewer 软件放大20 倍后进行观察并截取图片。Quant center densito quant 分析软件自动识别染色强度,将图中深棕色判定为(+++),计为3 分,棕黄色判定为(++),计为2 分,浅黄色为(+),计为1 分,蓝色细胞核为(-),计为0 分。根据公式[H-Score =∑pi(i+1)=(1×弱染色%)+(2×中度染色%)+(3×强染色%)](式中pi 表示阳性细胞数量占切片中所有细胞数量的百分数;i 代表着色强度),计算H-Score 评分。H-Score 为0~300分,评分越高说明综合阳性强度越强。
1.4 统计学处理采用SPSS 24.0统计软件进行分析,计量数据以均数±标准差(±s)表示,组间比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组犬肝组织HE 染色结果两组犬正常肝组织HE 染色结果显示,肝小叶结构完整,未见明显坏死、空泡化、充血及炎症反应等(图1-a、1-b)。常温下犬肝热缺血20 min 后,两组肝组织HE 染色结果显示,肝小叶结构大致完整,大量肝细胞肿胀,胞质疏松淡染,肝窦及汇管区可见大量出血,未见明显坏死、空泡化及炎症反应等(图1-c、1-d)。实验组犬肝组织经离体ECMO 全血灌注2 h 及HTK 器官保存液冷保存2 h 后,其肝小叶大概结构完整,肝细胞肿胀较多,且部分肝细胞空泡化,但无明显充血及炎症反应等(图1-e)。对照组犬肝组织经HTK 冷保存2 h 后,肝小叶结构不完整,大量肝细胞胞质内可见大量圆形空泡,肝窦扩张广泛(图1-f)。
图1 两组犬肝组织HE染色结果(×40)
2.2 两组犬肝组织透射电镜下染色结果两组犬正常肝细胞核(N)呈卵圆形大而饱满,核仁(Nu)较大,常染色质着色浅,细胞核孔清晰可见。细胞质内可见丰富的线粒体(M)、粗面内质网(RER)及糖原(GL)颗粒(图2-a、2-b)。常温下犬肝热缺血20 min 后,两组电镜下可见肝细胞核形态饱满,但核仁消失。线粒体数量明显减少且体积缩小;粗面内质网上的核糖体减少(图2-c、2-d)。实验组犬肝组织经离体ECMO全血灌注2 h 及HTK 器官保存液冷保存2 h 后,电镜下可见细胞核呈圆形大而饱满,核仁明显;线粒体丰富,分布均匀且形状规则;粗面内质网丰富,未见明显脱颗粒;胞质内糖原丰富,未发生明显病变(图2-e)。对照组犬肝组织经HTK 冷保存2 h 后,电镜下肝细胞核异形,核仁消失;线粒体形状不规则,嵴略模糊部分嵴消失;粗面内质网有脱颗粒发生及灶性溶解发生(图2-f)。
图2 两组犬肝组织透射电镜下染色结果(×24 000)
2.3 两组犬肝组织内TNF-α 的H-Score 评分结果比较实验组犬经离体ECMO 全血灌注2 h 后肝组织中TNF-α 表达的H-Score 评分高于灌注前(P<0.05);经HTK冷保存2 h后,实验组犬肝组织中TNF-α表达的H-Score 评分显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。对照组经HTK 冷保存2 h 后,犬肝组织中TNF-α 表达的H-Score 评分显著高于正常肝组织和热缺血20 min 后,差异均有统计学意义(P<0.05)(表1)。
表1 犬肝组织内TNF-α表达的H-Score评分(±s,分)
表1 犬肝组织内TNF-α表达的H-Score评分(±s,分)
分组正常肝组织热缺血20 min后HTK冷保存2 h后实验组(n=3)对照组(n=3)ECMO全血离体灌注灌注前134.59±10.20灌注2 h后141.02±12.67 tP 130.12±10.97 131.30±9.53 0.207 0.356 133.79±8.65 132.89±10.96 0.315 0.729 138.15±12.16 162.90±11.81 8.512 0.002
3 讨论
目前,如何改善和提高边缘性供肝功能,已成为国内外研究热点[2,5]。一些肝移植中心已通过将EC⁃MO 安装在心脏性死亡器官捐献供体体内转流而获得满意疗效。肾脏转运器(Life Port)已成功用于离体供肾的长途转运和抢救性治疗,受此启发,一些肝移植学者提出能否将ECMO 用于已离体的边缘性供肝的维护和复转[6-8]。本实验采用ECMO 体外转流和全血灌注技术,探讨其在提高离体的边缘性供肝功能中的可行性及价值,为延长供肝的保存时间和保证长途转运的安全性提供参考。
缺血损伤是原发性移植肝功能障碍的一个主要因素。热缺血和冷缺血时间延长是导致肝脏保存损伤的主要原因。对于心脏死亡器官捐献供体,在获取供肝前,其全身情况较差,供肝往往处于较长时间且隐匿的低灌状态。理论上,离体供肝的热缺血时间一般不宜超过5 min,冷缺血时间不宜超过14 h,否则将加重肝脏损伤,导致移植术后恢复时间延长、胆管狭窄和移植肝存活率下降[9-11]。基于此,本实验采用ECMO体外转流和全血灌注技术,使供肝重新获得持续而有效的血流及必要的营养素和氧气。结果显示,与对照组相比,实验组犬肝组织内小叶形态结构更完整,肝细胞变性、坏死更少;在超微结构显示肝细胞核及胞浆内的线粒体、粗面内质网等细胞器的形态和数量更丰富;组织间隙的炎症因子水平(TNFα)也更低,初步说明该技术在维护肝小叶结构及细胞形态的完整性,减轻热缺血及缺氧性损伤,以及促进边缘性供肝功能的修复是可行而有价值的。
综上所述,ECMO 全血离体灌注在一定程度上能改善边缘性供肝的功能,如何更好地应用于临床还值得深入研究。