黄皮疣柄牛肝菌多糖结构鉴定及对小鼠盲肠与粪便中短链脂肪酸的影响

樊莹润，郑婷婷，李泽林，沈晓静，王雪峰，谷大海，肖智超，范江平,*

（1.云南农业大学食品科学技术学院，云南 昆明 650201；2.普洱茶研究院，云南 普洱 665000）

近年来，随着人工驯化菌和野生菌的食用频率以及开发利用率的提高，人们对真菌的研究越来越多，特别是其菌多糖的生物活性得到了研究者的广泛关注；大量研究表明，香菇、银耳、金针菇、灵芝、云芝、茯苓、冬虫夏草、黑木耳、猴头菇等食用或药用真菌中的多糖组分具有提高身体免疫等功能，部分还具有抗肿瘤、抗衰老、降血糖和血脂、保肝、抗凝血等作用。黄皮疣柄牛肝菌又称黄癞头（（Letellier.）Watliag），属真菌界（Fungi）、担子菌门（Basidiomycota）、伞菌纲（Agaricomycetes）、牛肝菌目（Boletales）、牛肝菌科（Boletaceae）、疣柄牛肝菌属（），其菌肉细嫩、味道鲜美，富含蛋白质、多糖以及人体所需的8种必需氨基酸，其中以谷氨酸含量最高。本研究团队前期采用水提醇沉法提取了黄皮疣柄牛肝菌多糖（polysaccharides from(Letellier.) Watliag，LCP），提取率达18.44%，对其纯化后进行免疫活性以及抗氧化活性探究，发现具有较好的免疫调节活性和抗氧化活性。但是对LCP维持肠道健康相关的研究还很少。

多糖类物质由于分子质量大、结构复杂，不易被胃肠消化酶消化。未被消化的多糖进入大肠，被厌氧菌进一步降解及发酵，主要降解和代谢产物为寡糖及短链脂肪酸，这些寡糖和短链脂肪酸可以被人体直接吸收并发挥各种生理功能，对人体健康产生有益的影响。多糖作为一种天然的“免疫调节剂”及“微生态调节剂”，可通过免疫调节来改善肠道免疫系统紊乱所导致的机体炎症反应，也可通过调节肠道菌群、改善肠道组织、促进短链脂肪酸的产生来缓解代谢综合征、减轻炎症、增强免疫反应以及改善肠道黏膜屏障等，为肠道提供一个良好的内部环境。短链脂肪酸作为特定肠道厌氧菌在膳食纤维和抗性淀粉发酵后产生的主要细菌代谢产物，具有许多生理作用，如乙酸可以通过调控基因转录因子与信号通路促进脂肪细胞分化、抑制脂肪沉积和改善肥胖引发的胰岛素抵抗；丙酸主要由肠道菌群中的优势菌群拟杆菌门参与代谢生成，经结肠吸收后由肝脏代谢参与糖异生作用并用作能源；丁酸被认为是维持结肠稳态的主要因素，能被肠道迅速吸收，是结肠上皮的主要能量来源，在预防某些疾病（如肿瘤、炎症障碍、糖尿病、心血管疾病等）方面具有潜在价值。张冠亚对铁皮石斛多糖保持肠道健康作用进行研究，发现该多糖能有效地降低小鼠盲肠结肠内容物、体外粪便的pH值以及增加盲肠、结肠、粪便中的短链脂肪酸的含量。胡婕伦发现车前子多糖能减缓葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）引起的结肠炎症状，使患结肠炎小鼠粪便中短链脂肪酸含量的下降趋势减缓。段萌萌发现褐藻多糖可以改善高脂饮食诱发的代谢综合征，包括使高脂小鼠粪便中短链脂肪酸含量的下降趋势减缓。宋倩倩对绿豆皮多糖对小鼠肠道健康影响进行研究，发现绿豆皮多糖灌胃增加了小鼠结肠长度和短链脂肪酸含量，绿豆皮多糖可能通过酵解产生的短链脂肪酸改善肠道微环境并有益于提高小鼠的肠道健康状态。

目前，对LCP的研究主要集中在提取工艺以及体外抗氧化和调节免疫活性等方面。前期研究发现LCP能够增加小鼠粪便含水率、降低粪便pH值、缩短排便时间、促进小肠蠕动及结肠发育。因此，本实验旨在对LCP结构进行表征并研究其对小鼠盲肠内容物及粪便中短链脂肪酸的调节作用，以期对LCP维持肠道健康及其构效的深入研究提供实验基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

BALB/c雄性小鼠（体质量16～18 g）（生产许可证号：SCXK（滇）K2020-0004）。

新鲜黄皮疣柄牛肝菌产自楚雄彝族自治州南华县，从云南省易门县康源菌业有限公司采购。

AB-8大孔树脂 河北美凯化工有限公司；盐酸、氯仿 成都市科隆化学品有限公司；氢氧化钠、正丁醇、苯酚 天津风船化学试剂科技有限公司；无水乙醇四川西陇科学有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP） 上海瀚思化工有限公司；透析袋MD34（7 000 D）、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、岩藻糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、核糖、葡聚糖 上海源叶生物科技有限公司；低聚果糖（fructo-oligosaccharides，FOS） 上海麦克林生化科技有限公司；磷酸、乙醚、三氟乙酸 国药集团化学试剂有限公司；木糖、葡萄糖、异丁酸、正丁酸 美国TMstandard公司；乙酸 德国Dr.Ehrenstorfer公司；丙酸瑞士Fluka公司；异戊酸、正戊酸 德国CNW公司。

1.2 仪器与设备

UV-2450紫外分光光度计 岛津仪器（苏州）有限公司；1200型高效液相色谱仪（紫外检测器）、7890B-7000D气相色谱-质谱仪 美国Agilent公司；ELEOS凝胶色谱仪 美国Wyatt公司；激光检测器、示差检测器 美国Warers公司；Tensor27傅里叶变换红外光谱仪 德国Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 LCP的制备

黄皮疣柄牛肝菌洗净、切片、冻干、打粉过80 目筛后，采用热水法提取LCP，按液料比34∶1（/）混匀，51 ℃水浴3.1 h，4 000 r/min离心10 min得到提取液，50 ℃旋转蒸发浓缩至原体积的1/5，加入4 倍体积的无水乙醇（注意需要缓慢加入，边搅拌边加入），置于4 ℃冰箱中静置过夜，4 000 r/min离心10 min，取沉淀用适量的去离子水溶解，得到多糖溶液，冷冻干燥后得到粗多糖。配制100 mL质量浓度为2 mg/mL的粗多糖溶液，添加7 g大孔树脂后，放入53.3 ℃、130 r/min的恒温振荡箱中振荡5.3 h，以达到脱色的效果。过滤得到滤液，50 ℃进行旋转蒸发浓缩至原体积的1/2，将Sevag溶液（（氯仿）∶（正丁醇）＝4∶1）与多糖溶液按一定比例混合（1∶4，/），剧烈振荡20 min，4 000 r/min离心10 min，取上层水层，重复此步操作，直至没有白色蛋白沉淀层产生为止，旋蒸去除有机溶剂，透析48 h，冷冻干燥得到精多糖LCP。采用苯酚-硫酸法对LCP的多糖质量分数进行测定，确定其纯度。

1.3.2 LCP紫外光谱分析

将LCP配制成质量浓度为0.5 mg/mL的多糖溶液，在波长190～400 nm下进行紫外全波长扫描。

1.3.3 LCP的单糖组成分析

称取适量样品于水解管中，加1 mL去离子水和1 mL 4 mol/L三氟乙酸，充氮，110 ℃水解2 h，冷却至室温，取0.1 mL水解液于4 mL离心管中，在60 ℃真空干燥箱中干燥2 h。向4 mL离心管中加入0.3 mol/L NaOH和0.5 mol/L PMP甲醇溶液各0.5 mL，充氮，70 ℃水浴60 min，冷却至室温，加0.5 mL 0.3 mol/L HCl、0.75 mL去离子水、1.5 mL氯仿，振荡摇匀后静置分层，弃去下层氯仿，萃取3 次，水层过膜上机（高效液相色谱仪）。液相色谱条件：检测波长245 nm，SHISEIDO C色谱柱（250 mmh4.6 mm，5 μm），流速1.0 mL/min，柱温为25 ℃，进样量10 mL。

1.3.4 LCP分子质量测定

LCP分子质量采用凝胶渗透色谱法测定。色谱条件为：Shodex OHpak系列SB-806和SB-803两根GPC色谱柱串联，ELEOS凝胶色谱仪，检测器采用激光检测器和示差检测器串联使用，流动相为0.05 mol/L硫酸钠＋0.02% NaN，流速1 mL/min，柱温40 ℃，进样量500 mL。测定方法：取葡聚糖制成标准品溶液，过滤后，在上述色谱条件下进样，记录色谱峰保留时间，以响应值为纵坐标，以保留时间为横坐标，绘制标准曲线。样品配制成溶液在同样的色谱条件下进样，根据保留时间计算分子质量。

1.3.5 LCP红外光谱分析

称取1 mg LCP，采用KBr压片法压片后，利用傅里叶变换红外光谱仪进行扫描。扫描范围为3 800～600 cm，分辨率为4 cm，扫描次数为16。

1.3.6 LCP对小鼠盲肠内容物及粪便中短链脂肪酸的影响

1.3.6.1 动物分组与给药

60只雄性BALB/c小鼠适应7 d后随机分为空白对照（blank control，CON）组、阳性对照（FOS）组、LCP高剂量（HIGH）组、LCP中剂量（MED）组、LCP低剂量（LOW）组，每组12只。CON组每天按10 mL/kg灌胃去离子水，共30 d。阳性对照FOS组按80 mg/kg灌胃FOS，共30 d。LCP高、中、低剂量组每天分别按160、80、40 mg/kg灌胃LCP，共30 d。

1.3.6.2 样本采集

在第30天收集小鼠粪便进行短链脂肪酸含量测定。第30天灌胃结束后，处死各组小鼠，解剖，取出盲肠，用取样勺取出盲肠内容物用于短链脂肪酸含量测定。

1.3.6.3 短链脂肪酸含量测定

取适量样品加入2 mL磷酸溶液（（磷酸）∶（去离子水）＝1∶3），涡旋均浆2 min，加入2 mL乙醚萃取10 min，4 000 r/min低温离心20 min；离心后取出乙醚相，再加入2 mL乙醚萃取，4 000 r/min低温离心10 min，离心后再次取出乙醚相，将两次萃取液合并挥发定容至2 mL，进样进行气相色谱-质谱分析。色谱条件：色谱柱为HP-INNOWAX色谱柱（25 mh0.20 mm，0.40 mm）；柱温为初温100 ℃保持5 min，以5 ℃/min升至150 ℃，再以30 ℃/min升至240 ℃，保持30 min；进样口温度为240 ℃；载气流速为1.0 mL/min；不分流。质谱条件：电子轰击离子源；离子源温度为200 ℃；传输线温度为250 ℃；轰击电压为70 eV；单离子扫描模式为定量离子60、73。短链脂肪酸的含量按下式计算。

式中：为试样中短链脂肪酸的含量/（mmol/g）；为试样测定液中短链脂肪酸的质量浓度/（mg/L）；为定容体积/mL；为稀释倍数；为试样的质量/g；为摩尔质量/（g/mol）。

1.4 数据统计与分析

数据以平均值±标准差表示，应用SPSS 21.0软件中Duncan检验进行差异显著性分析，＜0.05为具有统计学意义，表示差异显著，使用Graphpad prism 5软件作图。

2 结果与分析

2.1 LCP结构分析

经过苯酚-硫酸法测定LCP多糖质量分数达到89.11%，纯度较高，后续对LCP进行结构分析。

2.1.1 LCP紫外光谱分析

如图1所示，在波长190～400 nm内，LCP在波长200 nm附近具有特征吸收峰，表明该样品属于多糖类物质；在波长260 nm处有一个较小的吸收峰，表明含有少量核酸，在波长280 nm处有也具有较小吸收峰，表明该多糖含有少量蛋白质。说明黄皮疣柄牛肝菌作为一种富含蛋白质的食用菌，采用单一的Sevag方法，不能完全脱掉其中的蛋白成分，因此后期实验需进行多种方式结合法进行脱蛋白处理。

图1 LCP的紫外吸收光谱图Fig.1 UV-visible absorption spectra of LCP

2.1.2 LCP单糖组成分析

由图2可知，LCP由7种单糖组成，分别为甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖，其物质的量比为4.34∶0.35∶0.08∶13.39∶3.35∶0.75∶1.80；其中，葡萄糖质量百分比大约占56.3%，甘露糖质量百分比大约占18.2%，半乳糖质量百分比大约占14.1%，岩藻糖质量百分比大约占6.9%，说明LCP主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖3 类单糖组成。

图2 LCP高效液相色谱图Fig.2 High performance liquid chromatogram of LCP

2.1.3 LCP分子质量

结合图3、表1可知，LCP有一个色谱峰，其分散系数较大，属于宽分布的多分散体系。重均分子质量为1.540h10Da。

图3 LCP凝胶色谱图Fig.3 Gel permeation chromatogram of LCP

表1 LCP分子质量及其分布Table 1 Molecular mass and distribution of LCP

2.1.4 LCP红外光谱分析

如图4所示，LCP在3 800～600 cm范围内具有多糖典型特征吸收峰。在3 325.00 cm处为OüH的伸缩振动；2 925.32 cm处的吸收峰为CüH键的伸缩振动；1 652.07 cm处的吸收峰是C＝O键伸缩振动；1 424.68 cm处的吸收峰为C＝O对称伸缩振动，是糖醛酸中质子化羧基特征峰，说明LCP含有糖醛酸，与单糖组成分析结果一致；1 373.1 cm处的吸收峰是CüH的弯曲振动；在1 200.76 cm及1 063.16 cm处的吸收峰由CüOüH和糖环CüOüC的两种CüO键伸缩振动所引起，且1 200.76 cm及1 063.16 cm处吸收峰为吡喃糖苷特征吸收峰，说明结构中存在-(1→6)糖苷键；在916.11 cm处出现的微弱吸收峰表明-型糖苷键的存在，表明多糖是吡喃型多糖；652.06 cm处为C≡CH键的弯曲振动峰的基频峰。以上结果说明LCP是含有-(1→6)糖苷键以及-型糖苷键的吡喃型多糖。

图4 LCP的傅里叶变换红外光谱图Fig.4 Fourier transform infrared (FTIR) spectrum of LCP

2.2 LCP对小鼠盲肠内容物及粪便中短链脂肪酸的影响

2.2.1 LCP对小鼠盲肠内容物中短链脂肪酸含量的影响

图5为灌胃30 d后，各组小鼠盲肠内容物中短链脂肪酸的含量，与CON组对比，高剂量LCP能显著增加小鼠盲肠中乙酸、丙酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸含量（＜0.05）；阳性对照FOS仅对小鼠盲肠内容物中正丁酸含量有显著增加的作用（＜0.05），中剂量LCP能显著增加小鼠盲肠内容物中异丁酸、正戊酸含量（＜0.05）。总体来看，LCP对小鼠盲肠内容物中短链脂肪酸的影响有一定量效关系。高剂量LCP能显著增加盲肠内容物中除正丁酸外的其他各类短链脂肪酸的含量。

图5 LCP对小鼠盲肠短链脂肪酸含量的影响Fig.5 Effect of LCP on short-chain fatty acid production in mouse cecum contents

2.2.2 LCP对粪便中短链脂肪酸含量的影响

各组小鼠在经过30 d的灌胃后粪便中的短链脂肪酸含量如图6所示。高、中、低剂量LCP组阳性对照FOS组乙酸含量与CON组各短链脂肪酸含量之间都具有显著性差异（＜0.05），其中高剂量LCP组乙酸含量最高，达到9.28 mmol/g，其次是阳性对照FOS组的乙酸含量较高，达到8.51 mmol/g，高、中、低剂量LCP 3 组乙酸含量呈剂量依赖性上升，CON组乙酸含量最低，为7.33 mmol/g。对比丙酸含量，低剂量LCP组丙酸含量最低（3.59 mmol/g），其次为CON组、阳性对照FOS组和中剂量LCP组，高剂量LCP组的丙酸含量最高，达到4.38 mmol/g。对比各组正丁酸的含量，高、中、低剂量LCP 组以及阳性对照FOS组都显著高于CON组（＜0.05），且小鼠粪便中正丁酸含量与LCP呈剂量依赖性，正戊酸含量结果与该结果一致。从异丁酸及异戊酸结果看，高剂量LCP组粪便中异丁酸及异戊酸含量显著高于其他各组（＜0.05），阳性对照FOS组粪便中异丁酸及异戊酸含量显著低于CON组（＜0.05）。

图6 LCP对小鼠粪便短链脂肪酸含量的影响Fig.6 Effect of LCP on short-chain fatty acid production in the feces of mice

3 讨 论

由单糖组成可以发现LCP主要是由葡萄糖、甘露糖、半乳糖组成；对比其他牛肝菌科的多糖，可以发现其主要单糖也是以上3种，如日本海氏牛肝菌、海南黄肉牛肝菌、橙牛肝菌、长颈金牛肝菌、褐黄牛肝菌等。不同种类的牛肝菌多糖的分子质量存在较大的差异，其分子质量跨度较大，目前研究发现，海南黄肉牛肝菌（最小）的分子质量为5 286 Da，白牛肝菌（最大）则大于2.00h10Da；对比LCP的分子质量1.540h10Da，可以发现LCP的分子质量适中，分子质量的大小会影响多糖被肠道微生物的酵解情况，分子质量太大会造成微生物酵解较困难；较小分子质量的多糖可能在胃肠道就被降解不能进入大肠被肠道微生物利用；分子质量适中更有利于被肠道微生物利用，将其降解为寡糖和短链脂肪酸供肠道上皮细胞吸收及利用。

盲肠内容物和粪便中短链脂肪酸是由肠道微生物在厌氧条件下对未消化的可溶性碳水化合物酵解而转化来的。多糖类物质基本不能被消化道消化，需要进入大肠被肠道菌群酵解，由于其结构以及单糖组成不同，在酵解过程中将会转化为不同的短链脂肪酸。综合近年来体外模拟人体结肠酵解多糖的研究可发现，乙酸主要由葡萄糖醛酸、木糖、果胶、半乳糖、半乳糖醛酸酵解产生，丙酸由葡萄糖、木糖、阿拉伯糖酵解产生，丁酸由木糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、半乳糖醛酸产生，木糖对丁酸产生影响最大，单糖含量中甘露糖与葡萄糖含量更高，可以产生更高的丁酸。

根据小鼠灌胃30 d后粪便中短链脂肪酸含量来看，高剂量LCP可以显著增加小鼠粪便中乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸的含量（＜0.05）；FOS可以增加小鼠粪便中乙酸、丙酸、正丁酸的含量。对比小鼠灌胃30 d后盲肠内容物中短链脂肪酸含量，高剂量LCP可以增加小鼠盲肠内容物中乙酸、丙酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸的含量，对异丁酸、正戊酸的影响最为明显；FOS只对小鼠盲肠内容物中正丁酸促进作用，这可能与FOS作用剂量以及作用时间有关系。通过LCP对小鼠盲肠内容物及粪便中短链脂肪酸影响以及LCP的单糖组成，可以发现乙酸含量的增加可能是由葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖被酵解，丙酸含量的增加可能是葡萄糖、木糖被酵解，丁酸、戊酸含量的增加可能与木糖、甘露糖有很大关系，与其他种类的多糖相比，LCP的单糖组成中甘露糖与葡萄糖的质量百分比更高；有研究表明，猴头菇多糖消化过程中发现产生大量的游离甘露糖，对其酵解时也产生了戊酸，并且酵解一些不含甘露糖的多糖时几乎不产生戊酸。研究表明灵芝多糖体内酵解乙酸、丙酸和丁酸含量的增加可能是由于在大肠中发酵葡萄糖、半乳糖和甘露糖所致。

目前，由于对LCP的研究相对较少，所以参考一些其他菌类多糖，对其结构研究没有深入到糖苷键类型确定方面，在下一阶段可以通过进行甲基化、高碘酸氧化、Smith降解、核磁共振等来进一步确定。另外，有研究发现灵芝多糖诱发结肠中乙酸、丙酸和丁酸的生成增加，可能对2型糖尿病和相关疾病的治疗具有应用潜力，高脂血症小鼠通过肠道微生物群将海参多糖转化为短链脂肪酸参与肝脏的脂质代谢，因此对于LCP的研究可以深入到进一步确定该多糖在小鼠肠道结肠还是盲肠或者哪一段发生酵解，可以通过肝脏以及血液中短链脂肪酸变化来确定LCP对小鼠代谢影响，体内及体外实验结合研究LCP对肥胖、糖尿病、肠炎等疾病的影响。

4 结 论

LCP的结构中单糖组成为甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖，其物质的量之比为4.34∶0.35∶0.08∶13.39∶3.35∶0.75∶1.80；重均分子质量为1.540h10Da；是含有-(1→6)糖苷键以及-型糖苷键的吡喃型多糖；LCP能显著增加小鼠盲肠内容物及粪便中乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸6 类短链脂肪酸的含量，且呈剂量依赖性。在粪便中，LCP表现出对正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸影响更大，在盲肠内容物中，LCP表现出对异丁酸、正戊酸影响更大。不同剂量的LCP中，高剂量LCP对小鼠产生短链脂肪酸的影响最大。