补肾活血方对卵巢功能早衰大鼠卵巢组织外泌体相关膜蛋白的影响

李涵 刘慧萍 肖贾丽珏 杨开锋 辛雨霏

〔摘要〕 目的 观察补肾活血方对卵巢功能早衰模型大鼠卵巢组织中外泌体相关膜蛋白表达情况及卵巢组织形态和功能的影响。方法 选取30只大鼠，腹腔注射顺铂建立卵巢功能早衰模型，造模成功后随机分为模型组、阳性对照组和中药低、中、高剂量组，每组6只。另取6只大鼠为空白组。空白组和模型组大鼠每天灌胃蒸馏水;中药低、中、高剂量组分别按每天9.72、19.44、38.88 g/kg剂量补肾活血方灌胃;阳性对照组大鼠按每天0.09 mg/kg剂量灌胃给药戊酸雌二醇片，连续21 d。每周称体质量，计算体质量增量，每天观察大鼠动情周期。末次给药后于第2天取血和卵巢、胸腺、脾脏，称脏器质量，计算脏器指数;ELISA检测大鼠血清中雌二醇（estradiol 2， E2）和抗米勒管激素（anti-Müllerian hormone， AMH）水平变化含量;HE染色观察卵巢形态变化;免疫组织化学法检测卵巢组织中外泌体膜蛋白CD63、CD81、CD82的表达水平;透射电镜观察大鼠外周血外泌体形态;Western blot检测大鼠外周血外泌体相关蛋白。结果 与空白组相比，模型组动情周期紊乱、AMH和E2减少（P<0.05，P<0.01），體质量和体质量增量明显减少（P<0.01），卵巢指数、胸腺指数明显减少而脾脏指数明显升高（P<0.01），卵泡数和成熟卵泡明显减少，闭锁卵泡增多，卵巢组织CD63、CD81、CD82蛋白表达明显下降（P<0.01）。与模型组相比，中药中、高剂量组和阳性对照组AMH和E2显著升高（P<0.01），中药高剂量组和阳性对照组动情周期恢复正常，体质量及体质量增量明显升高（P<0.01），卵巢指数、胸腺指数明显升高而脾脏指数降低（P<0.05，P<0.01），给药组卵泡数依次增多，中药高剂量组和阳性对照组蛋白表达明显升高（P<0.01）。透射电镜和Western blot证明大鼠外周血外泌体提取成功。结论 补肾活血方可以明显改善卵巢功能早衰的情况，其改善卵巢形态和功能的机制可能与提高外周血和卵巢中外泌体活性有关。

〔关键词〕 卵巢功能早衰;补肾活血方;外泌体;抗米勒管激素;雌二醇;动情周期

〔中图分类号〕R271.9       〔文献标志码〕A        〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.06.003

Effect of Bushen Huoxue Recipe on exosome-related membrane proteins in ovarian

tissue of rats with premature ovarian failure

LI Han， LIU Huiping*， XIAO Jialijue， YANG Kaifeng， XIN Yufei

（Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of Bushen Huoxue Recipe on the expression of exosome-related membrane proteins in ovarian tissue and the morphology and function of ovarian tissue in rats with premature ovarian failure. Methods A total of 30 rats were selected and injected with cisplatin intraperitoneally to establish the mode of premature ovarian failure. After successful modeling， they were randomly divided into model group， positive control group， low， middle and high dose groups of traditional Chinese medicine， with six rats in each group. Another six rats were selected as blank group. Rats in the blank group and model group were gavaged with distilled water every day， the rats in the low， middle and high dose groups of traditional Chinese medicine were given intragastric administration of Bushen Huoxue Recipe at the dose of 9.72， 19.44 and 38.88 g/kg， respectively， and the rats in the positive control group were given estradiol valerate tablets at the dose of 0.09 mg/kg every day for 21 d. The body weight was weighed every week， the body weight increment was calculated， and the estrous cycle of rats was observed every day. After the last administration， on the second day， the blood， ovary， thymus and spleen were taken， the organ weight was weighed and the organ index was calculated. The levels of estradiol （estradiol 2， E2） and anti-Müllerian hormone （AMH） in serum were detected by ELISA; the morphological changes of ovary were observed by HE staining; the expression levels of CD63， CD81 and CD82 in ovarian tissue were detected by immunohistochemical method. The morphology of exocrine body in rat peripheral blood was observed by transmission electron microscope， the exocrine related protein in rat peripheral blood was detected by Western blot. Results Compared with the blank group， the estrous cycle disorder， AMH and E2 were decreased （P<0.01， P<0.05）， the body weight and body weight increment were significantly decreased （P<0.01）， the ovarian index and thymus index were significantly decreased， and the spleen index was significantly decreased， the number of follicles and mature follicles decreased significantly， the atretic follicles increased， and the protein expression levels of CD63， CD81， and CD82 in ovarian tissue decreased significantly （P<0.01） in the model group. Compared with the model group， AMH and E2 in the medium and high dose groups of traditional Chinese medicine and the positive control group were significantly increased （P<0.01）. The estrous cycle in the traditional Chinese medicine high-dose group and the positive control group returned to normal， and the body weight and body weight increment increased significantly （P<0.01）， the ovarian index and thymus index were significantly increased while the spleen index was decreased （P<0.01， P<0.05）， the number of follicles in the administration group increased in turn， and the protein expression in the traditional Chinese medicine high-dose group and the positive control group was significantly increased （P<0.01）. Transmission electron microscopy and Western blot proved that the extraction of exosomes from peripheral blood of rats was successful. Conclusion Bushen Huoxue Recipe can significantly improve the situation of premature ovarian failure， and the mechanism of improving ovarian morphology and function may be related to the increase of peripheral blood and ovarian exocrine activity.26B27259-3B61-4944-B236-2C38F1FAA5F1

〔Keywords〕 premature ovarian failure; Bushen Huoxue Recipe; exosome; anti-Müllerian hormone; estradiol 2; estrous cycle

卵巢功能早衰（premature ovarian failure， POF）是指在女性40岁之前出现围绝经期综合征，而月经初潮年龄正常或延迟、第二性征发育正常[1]。POF导致女性提前老龄化，出现持续6个月以上闭经，生殖器官萎缩，性功能降低甚至不孕，促卵泡激素和黄体生成素质量浓度升高，雌二醇（estradiol 2， E2）和抗米勒管激素（anti-Müllerian hormone， AMH）质量浓度降低的一种妇科内分泌性疾病[2]。临床上，POF患者表现为月经失调甚至闭经、不孕、性欲低下、阴部干燥、生殖器及第二性征逐渐退化等围绝经期症状[3]。POF可以分为两类，一类是卵泡数量的消失，一类是卵泡功能的消失[4]。西医认为此病病因复杂，治疗比较困难，目前主要采用性激素替代疗法，但不能恢复卵巢周期性功能，且有明显副作用[5]。POF可归属于中医学“闭经”“不孕”“血枯”等范畴[6]。补肾活血方是国家名老中医尤昭玲教授的经验方，已在临床应用多年，对早发性卵巢功能不全有良好疗效[7]。

近几年外泌体的研究，尤其是在妇科疾病诊疗领域的研究成为一个热点[8]。外泌体是细胞间通讯的关键参与者，可调节免疫反应、炎症、感染和肿瘤等病理生理过程[9]。外泌体由蛋白质、脂质、核酸等组成。外泌体的蛋白质主要包括膜蛋白（CD9、CD63、CD81、CD82）、热休克蛋白（HSP60、HSP70、HSP90）、膜联蛋白（膜联蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ）、胞质蛋白（肌动蛋白、微管蛋白）和细胞特异性抗原（MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ）[10-14]。外泌体在卵母细胞的生长发育中起着非常重要的作用，POF与外泌体的减少有一定关联。随着外泌体的研究深入，人们发现干细胞中外泌体对早发性卵巢功能不全或POF的治疗有很好的疗效，这也为POF的治疗提供新思路[15-17]。本研究通过建立POF大鼠模型，采用具有滋阴、益气、活血功效的补肾活血方治疗，初步研究了补肾活血方对于POF大鼠的干预作用以及对外泌体的调节作用，为POF的发病机制研究和治疗提供新的思路。

1 材料

1.1  动物

SPF级SD雌性大鼠36只，体质量（150±10） g，6周龄，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SYXK（湘）2019-0009。3只一笼饲养于湖南中医药大学动物实验中心SPF级屏障环境中，安静状态下，于消毒灭菌IVC笼里喂养，饮水不受限制、颗粒型饲料喂养，每3天换1次灭菌垫料和水。饲养环境尽量通风，12 h明暗周期，温度控制在25 ℃，相对湿度50%～60%。本实验由湖南中医药大学动物伦理委员会批准，动物实验伦理审查编号：LLBH-202011140001，大鼠均适应性喂养1周后继续相关实验。

1.2  药品

所有中药饮片均购买自湖南中医药大学第一附属医院。补肾活血方药物组成：熟地黄15 g，酒黄精12 g，枸杞子12 g，酒山茱萸12 g，当归15 g，白芍12 g，川芎9 g，丹参12 g，燀桃仁9 g（批号分别为2008303、200803、NG20090902、TH20082402、TH20090301、TH20091405、TH20082404、HY20091606、2020082901），煎煮后用旋转蒸发仪浓缩，浓缩为生药含量4 g/mL;氯氨铂（25 mg，美国SIGMA公司，批号：MKCL0026）;戊酸雌二醇片（1 mg/片，德国拜耳公司，批号：558A）。

1.3  主要试剂

兔抗CD63抗体（美国Affinit公司，批号：Ab-AF5117）;兔抗CD81抗体、兔抗CD82抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司（批号分别为bs-6934R、bs-1470R）;外泌体提取试剂盒（上海贝博生物公司，批号：BB-39012）;兔抗ALIX抗体、兔抗FLOTILLIN 1、兔抗CD9抗体均购自上海艾博抗贸易有限公司（批号分别为ab88388、ab41927、ab92726）;BSA（武汉华美生物工程有限公司，批号：CSB-MC00031a0101）;山羊抗鼠（上海西格玛奥德里奇贸易有限公司，批号：A4416）;ECL发光试剂盒（美国通用电气公司，批号：RPN2109）;AMH、E2 ELISA试剂盒均购于江苏菲亚生物科技有限公司（批号分别为201230R35、201230R11）。

1.4  主要仪器

切片机、摊片机、双目显微镜均购自德国LEICA公司（型号分别为RM2235、HI1210、DMLB2）;生物显微镜（麦克奥迪实业集团公司，型号：Motic BA410）;凝胶成像分析系统、蛋白电泳及转膜设备均购自美国Bio-Rad公司（型号分别为ChemiDoc XRS、1704150）;高速离心机、高速台式离心机、超速离心机均购自美国Beckman公司（型号分别为J2-21、GS-15R、L-90K）;微量移液枪（德国艾本德公司，型号：3120000240）;脱色摇床（上海新波公司，型号：Ty-B）。

2 方法

2.1  POF大鼠模型制备与分组

将30只大鼠参照文献[18]建立POF模型，每次予顺铂4.0 mg/kg，隔周腹腔注射1次，共2次，通過每天观察动情周期，动情周期紊乱，大鼠体质量增长缓慢，毛发粗糙无光泽判断造模均成功[18]。空白组每次予生理盐水4.0 mg/kg，隔周腹腔注射1次，共2次。将造模成功后的30只大鼠按随机数字表法分为模型组、阳性对照组和中药低、中、高剂量组，每组6只。另取6只大鼠为空白组。26B27259-3B61-4944-B236-2C38F1FAA5F1

2.2  给药

空白组和模型组大鼠每天灌服蒸馏水;补肾活血中药组大鼠每天分别按38.88、19.44、9.72 g/kg高、中、低剂量灌胃，其中低剂量是大鼠与70 kg成人临床用量等效剂量，中剂量和高剂量分别为等效剂量的2倍与4倍;阳性对照组大鼠每天按0.09 mg/kg的剂量灌胃给药戊酸雌二醇片，与70 kg成人临床用量等效剂量相当。各组灌胃体积均为10 mL/kg，每天1次，连续给药21 d。

2.3  检测指标与方法

2.3.1  动情周期  于造模结束后第5～8天，参照文献[19]用10 mL移液枪吸取10 mL生理盐水在大鼠阴道内吹打几次后，吸出液体进行涂片。待自然干燥后滴加2滴瑞氏染液，1 min后加1.5倍的PBS，10 min后冲洗，待干燥后封片镜检。

2.3.2  ELISA检测大鼠血清中AMH和E2水平变化含量  于给药结束的第2天，同时所有大鼠禁食禁水8 h，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.4 mL/100 g），腹主动脉取血，3500 r/min，离心半径6 cm，离心15 min后取上清液置于-80 ℃冰箱内保存。按ELISA试剂盒说明书步骤操作，在450 nm波长下的酶标仪测定光密度，根据标准曲线计算各样本指标含量。

2.3.3  HE染色观察卵巢组织病理形态  取出两侧卵巢，称重后一侧置于-80 ℃冰箱内，一侧于4%多聚甲醛中浸泡。于多聚甲醛中浸泡的卵巢用梯度乙醇脱水后，用石蜡包埋，然后切片，HE染色，光学显微镜下观察卵巢形态大小及各级卵泡数以及总卵泡数。

2.3.4  脏器指数及体质量增量  取卵巢、脾脏、胸腺进行称量，计算脏器指数（脏器指数=脏器质量/体质量）。体质量增量即取材当天的体质量减去大鼠进动物房第1天的体质量。

2.3.5  免疫组织化学法检测卵巢组织中外泌体膜蛋白CD63、CD81、CD82  包埋切片后二甲苯脱蜡，过氧化氯溶液灭活后热修复，自然冷却后加CD63、CD81、CD82一抗（均按照1∶100稀释），PBS冲洗后加二抗（1∶200）。孵育及冲洗后DAB显色，自来水冲洗后染色，待干燥后封片拍照，并用MIAS医学图像分析软件分析图片，阳性表达显示为棕黄色。

2.3.6  血清外泌体的提取  按外泌体提取试剂盒操作。将血清4 ℃下3000×g离心15 min弃沉淀，再10 000×g离心20 min弃沉淀，加入提取液A混匀后加入提取液B混匀，4 ℃冰箱内过夜。第2天10 000×g离心60 min，弃上清液，用外泌体保存液重悬沉淀即得到外泌体样品。

2.3.7  透射电镜观察外泌体  取PBS重悬的外泌体悬液20 mL，滴于载样铜网上，室温静置2 min，用濾纸从滤网侧边吸干液体，用3%磷钨酸溶液30 mL在室温下负染5 min，滤纸吸干负染液，白炽灯烤干，将铜网安装于样品槽中，透射电镜下观察。

2.3.8  Western blot鉴定外泌体  提取的外泌体等体积加入RIPA裂解液和苯甲基磺酰氟，冰上裂解30 min后，样品分装冻存于-20 ℃冰箱内备用。测定蛋白浓度后制备分离胶，然后加入上样buffer混匀，沸水煮10 min，冰上5 min。加入样品开始电泳，电泳后将蛋白转至硝酸纤维素膜，然后脱脂牛奶室温封闭90 min后分别加入ALIX、FLOTILLIN和CD9一抗（均按照1∶1000稀释），4 ℃孵育过夜，加入二抗（1∶5000）室温孵育1 h，ECL显色后在凝胶成像系统中拍照。

2.4  统计学方法处理

应用SPSS 25.0软件进行统计学分析。计量资料以“x±s”表示，如果方差齐，则采用单因素方差分析比较组间数据，符合正态分布且方差齐者用LSD检验，如果方差不齐者用Tamhane检验，如果不符合正态分布者用非参数检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1  各组大鼠阴道脱落细胞病理形态

空白组大鼠有完整的动情周期，即动情前期、动情期、动情后期和动情间期;而模型组大鼠则长期处于动情前期和动情间期。详见图1。

3.2  各组大鼠血清中AMH和E2水平

与空白组比较，模型组AMH和E2水平均明显降低（P<0.05，P<0.01）。与模型组比较，中药中、高剂量组和阳性对照组AMH和E2水平均明显升高（P<0.01）。与模型组比较，中药低剂量组AMH水平明显升高（P<0.05）。中药低剂量组E2水平与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。与阳性对照组比较，中药低剂量组AMH水平明显降低（P<0.05）。中药各剂量组E2水平和中药中、高剂量组AMH水平与阳性对照组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。中药各剂量组间AMH和E2水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。详见表1。

3.3  各组大鼠体质量和脏器指数

与空白组比较，模型组卵巢指数、胸腺指数、体质量、体质量增量均明显减少（P<0.01），脾脏指数明显升高（P<0.01）。与模型组比较，中药高剂量组和阳性对照组卵巢指数、胸腺指数、体质量、体质量增量均明显升高（P<0.05，P<0.01），脾脏指数明显降低（P<0.05，P<0.01）。与模型组比较，中药中剂量组胸腺指数、体质量均明显升高（P<0.05）。中药中剂量组卵巢指数、脾脏指数、体质量增量与模型组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。中药低剂量组卵巢指数、胸腺指数、脾脏指数、体质量、体质量增量与模型组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。与阳性对照组比较，中药低剂量组卵巢指数、体质量和体质量增量均明显降低（P<0.05），脾脏指数明显升高（P<0.05）。中药低剂量组胸腺指数和中药中、高剂量组卵巢指数、胸腺指数、脾脏指数、体质量、体质量增量与阳性对照组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。与中药高剂量组比较，中药低剂量组卵巢指数、体质量、体质量增量均明显降低（P<0.05，P<0.01）。中药低剂量组胸腺指数、脾脏指数与中药高剂量组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。中药低剂量组与中药中剂量组、中药中剂量组与中药高剂量组间卵巢指数、胸腺指数、脾脏指数、体质量、体质量增量比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。详见表2。26B27259-3B61-4944-B236-2C38F1FAA5F1

3.4  各组大鼠卵巢组织病理形态学观察

空白组大鼠卵巢结构清晰，卵巢内可见正常卵泡;模型组大鼠卵巢结构紊乱，以初级卵泡和闭锁卵泡居多;中药低剂量组与模型组相似，但较模型组有一定改善;中药中剂量组开始出现一些成熟卵泡，且闭锁卵泡和初级卵泡减少;中药高剂量组和阳性对照组卵巢形态均明显改善，卵泡数量增多，有成熟卵泡，闭锁卵泡数量低，与空白组相似。详见图2。

3.5  各组大鼠卵巢组织中外泌体膜蛋白CD63、CD81、CD82表达

与空白组比较，模型组大鼠卵巢组织CD63、CD81、CD82蛋白表达均明显下降（P<0.01）。与模型组比较，中药高剂量组和阳性对照组CD63、CD81、CD82蛋白表达均明显升高（P<0.01）。中药低、中剂量组CD63、CD81、CD82蛋白表达与模型组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。与阳性对照组比较，中药低、中剂量组CD63、CD81、CD82蛋白表达均明显降低（P<0.05，P<0.01）。中药高剂量组CD63、CD81、CD82蛋白表达与阳性对照组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。与中药高剂量组比较，中药低剂量组CD63、CD81、CD82蛋白表达均明显降低（P<0.05，P<0.01），中药中剂量组CD82蛋白表达明显降低（P<0.05）。中药低剂量组与中药中剂量组、中药中剂量组与中药高剂量组间CD82蛋白表达比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。中药低剂量组与中药中剂量组、中药中剂量组与中药高剂量组间CD63、CD81蛋白表达比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。详见图3、表3。

3.6  各组大鼠透射电镜下外泌体形态观察

空白组、模型组、中药各剂量组和阳性对照组的外泌体均具有外泌体独特的双膜双杯状结构，而且电镜下的粒径范围为50～150 nm，符合文献[15]报道的外泌体粒径大小，说明各组外泌体提取成功。详见图4。

3.7  各组外泌体标志性蛋白鉴定

各组外泌体中均有标志性蛋白ALIX、FLOTILLIN和CD9的表达，说明提取的50～150 nm微粒为外泌体。详见图5。

4 讨论

POF是女性内分泌疾病的一种，也是临床上造成不孕的原因之一，其发病与免疫功能紊乱、遗传、放射治疗、化学治疗等因素相关[20-21]。

肾主藏精，主生殖。POF出现天癸衰竭，主要责之于肾精不足，不能司生殖之职。而肾虚精亏不能充养血脉及心、肝、脾、肺四脏，导致四脏气机郁滞，气为血之帅，气机不通则血液流通不畅，进而阻滞冲任，形成瘀血。瘀血阻滞经络胞宫，影响新血生成，进一步加重病情。而临床通过超声检查也发现POF患者卵巢动脉血流信号稀少纤细，或者流速过低难以探测，证明了瘀血是本病发展过程中的重要病理因素。这说明POF的中医病机主要为肾虚血瘀，所以补肾活血法也成为POF的主要治法。国家名老中医尤昭玲教授经多年临床实践，将左归丸化裁为补肾活血方，主要用来治疗肾虚血瘀型POF。补肾活血方由熟地黄、酒黄精、酒山茱萸、白芍、当归、川芎、燀桃仁、枸杞子、丹参这9味药组成。酒山茱萸为君药，可以补肾填精滋阴养血，白芍重在养血活血，且白芍可以增加E2的水平，对女性生殖系统疾病有疗效[22]。研究发现，补肾活血方主要通过调节免疫反应来来改善卵巢功能[23]以及可以抑制细胞凋亡[24-25]，从而达到治疗POF的目的，同时补肾活血方也可以通过调节相关信号通路修复大鼠卵巢的自噬损伤[26-27]。

HUANG等[28]发现将人脂肪干细胞来源外泌体移植到原发性卵巢功能不全（primary ovarian insufficiency， POI）小鼠模型后可以抑制颗粒细胞的凋亡，增加卵泡的数量，使卵巢功能得以修复。ZHANG等[29]发现人羊膜上皮细胞外泌体通过传递功能性miRNAs，抑制化疗诱导的颗粒细胞凋亡，同时还能减轻急性血管损伤，以此保护卵泡的发育。DING等[30]发现人脐带间充质干细胞来源外泌体可恢复POI模型小鼠的卵巢表型和功能，促进环磷酰胺损伤的人颗粒细胞和卵巢细胞的增殖。HAN等[31]首次证明了将来自中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary cell， CHO）的外泌体添加到CHO细胞培养液中，能显著抑制细胞的凋亡。细胞自噬与POF的发生有一定关联，现在一些研究表明外泌体和自噬之间通过共享分子和细胞器存在直接的联系，这对正常机体的生理病理有重要意义，自噬相关分子参与外泌体的生物发生过程而非自噬过程[32-34]，以自噬内涵体的形式进行的自噬和外泌体的释放之间是相互拮抗的关系。因此，本实验研究从补肾活血方是否有疗效以及是否对外泌体含量有影响入手，来观察补肾活血方与外泌体的相关性，补肾活血方是否可以通过提高外泌体的含量来治疗POF。

本研究结果显示POF大鼠模型动情周期紊乱，体质量增长缓慢，卵巢指数、脾脏指数、胸腺指数变小，卵巢出现萎缩变小，卵泡数目减少，闭锁卵泡增多，而且外周血外泌体和卵巢中的外泌体膜蛋白CD63、CD81、CD82表达降低。补肾活血方可以使动情周期恢复正常，改善卵巢组织形态，促进卵泡生长发育成熟，同时可以使POF大鼠体质量增加接近正常，卵巢指数、胸腺指数增加，脾脏指数降低，这可能与其增加外泌体的含量尤其是增加外周血外泌体和卵巢中的外泌体膜蛋白CD63、CD81、CD82有关。用药后POF大鼠的胸腺指数增加和脾脏指数降低，说明补肾活血方有一定的改善免疫功能作用。通過观察免疫组织化学法图片，可以发现卵巢组织中外泌体主要存在于卵泡液中。用药后，除模型组外其余各组都恢复正常的动情周期，因而结果中只将空白组和模型组进行对比。在用Western blot鉴定外泌体之前，通过其他实验结果发现中药低、中剂量组与模型组相比差异不大，因而选取疗效更好的中药高剂量组和阳性对照组与模型组和空白组进行外泌体的Western blot鉴定。上述实验说明补肾活血方对POF有一定的疗效，其作用机制可能与补肾活血方增加外周血和卵巢组织中的外泌体来控制和缓解POF有关。26B27259-3B61-4944-B236-2C38F1FAA5F1

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