土田七醇提物抑制肝癌细胞增殖活性部位筛选及其对肝癌细胞侵袭迁移的影响

陈成 刘毅 许汉林

〔摘要〕 目的 筛选土田七醇提物抗肝癌活性部位，并研究其对肝癌SMMC-7721细胞和HepG2细胞侵袭迁移的影响。方法 采用大孔树脂对土田七醇提物进行洗脱，并采用CCK-8法检测不同洗脱部位对肝癌细胞增殖的影响;建立荷瘤小鼠模型，通过瘤体质量变化评价不同洗脱部位的体内抗肿瘤作用;采用Transwell侵袭实验和细胞划痕实验检测肝癌细胞侵袭迁移能力。结果 土田七醇提物的大孔树脂不同洗脱部位均有抑制肝癌细胞增殖的作用，并可抑制裸鼠肿瘤的生长，其中70%洗脱部位的效果最好。Transwell侵袭实验和细胞划痕实验结果显示，70%洗脱部位可抑制肝癌细胞侵袭和迁移过程。结论 土田七醇提物的大孔树脂70%洗脱部位抗肝癌活性最好，并可抑制肝癌细胞侵袭迁移能力。

〔关键词〕 土田七;肝癌;醇提物;活性部位;侵袭;迁移

〔中图分类号〕R285.5       〔文献标志码〕A        〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.06.010

Screening of active fractions from the alcohol extract of Stahlianthus involucratus and its

effect on invasion and migration of hepatocellular carcinoma cells

CHEN Cheng， LIU Yi， XU Hanlin*

（Hubei University of Chinese Medicine， Wuhan， Hubei 430065， China）

〔Abstract〕 Objective To screen the anti-hepatocellular carcinoma active fractions from the alcohol extract of Stahlianthus involucratus， and investigate its effect on invasion and migration of SMMC-7721 and HepG2. Methods The alcohol extract of Stahlianthus involucratus was eluted by macroreticular adsorbents， followed by the CCK-8 to investigate the hepatocellular carcinoma cell proliferation treated by the different fractions. The tumor bearing mouse model was established and used to screen the antitumor effect in vivo with different fractions by the changes of the weight of tumor mass. The invasion and migration abilities of hepatocellular carcinoma cells were detected by Transwell chamber assay and scratch assay. Results Different fractions of macroreticular adsorbents from alcohol extract of Stahlianthus involucratus can inhibit the multiplication of hepatocellular carcinoma cells and inhibit the growth of tumor in nude mice. Among them， the fraction eluted with 70% ethanol has the best effect. Both Transwell chamber assay and scratch assay results showed that the fraction eluted with 70% ethanol can inhibit the migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells. Conclusion The 70% elution fraction of macroreticular adsorbents from alcohol extract of Stahlianthus involucratus has the best anti-liver cancer activity， which also could inhibit the invasion and migration of hepatocellular carcinoma cells.

〔Keywords〕  Stahlianthus involucratus; hepatocellular carcinoma; alcohol extract; active fraction; invasion; migration

肝癌是我國临床上常见的恶性肿瘤之一，由于其具有极强的侵袭转移能力，导致中晚期肝癌的死亡率仍然居高不下[1-5]。研究表明，约60%以上的患者在接受手术治疗后的5年内会出现复发和转移[6-9]。因此，探索抑制肝癌细胞侵袭迁移能力的方法是目前肝癌研究的热点之一，而姜科药用植物在抗肿瘤研究中的进展给人们提供了新的思路和策略。81B6BDB6-19C0-43D4-894C-F1D425D6FF42

土田七是姜科土田七属植物土田七[Stahlianthus involucratus （King ex Bak.） Craib]的干燥块根和根茎，中医学认为其具有活血止血、消肿散瘀的功效[10-11]。现代研究表明，土田七对多种类型的肿瘤细胞具有抑制和杀伤作用[12-14]。但目前土田七对肝癌SMMC-7721和HepG2细胞侵袭迁移的影响尚未见报道。本实验通过体内外抗肝癌药理试验，筛选出土田七醇提物抗肝癌活性最强的大孔树脂洗脱部位，并观察其对肝癌细胞侵袭迁移的影响，为土田七抗癌作用的研究提供实验基础和研究依据。

1 材料与方法

1.1  材料

1.1.1  细胞株与实验动物  肝癌细胞株SMMC-7721（上海翼和应用生物技术有限公司，批号：20180412-

01）和HepG2（上海信裕生物科技有限公司，批号：XY0022）。昆明小鼠（雄性，4～6周;体质量18～22 g），购自湖北省实验动物研究中心。动物生产许可证号：SCXK（鄂）2015-0018。

1.1.2  药材与试剂  药材购自云南省文山州，经湖北中医药大学的陈科力教授鉴定为土田七[Stahlianthus involucratus （King ex Bak.） Craib]。姜黄素标准品（上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98%，货号：B20614）;DMEM细胞培养基（美国HyClone公司，批号：8118269）;胎牛血清（武汉四季青生物制品公司，批号：18040502）;胰蛋白酶消化液（美国Gibco公司，批号：2323527）;PBS （美国HyClone公司，批号：AG29574691）;Annexin V -FITC/PI检测试剂盒（上海贝博生物技术公司， 批号：BB21061）;Matrigel基質胶（美国BD公司，批号：7156009）。

1.1.3  主要仪器  SW-CJ-2G型超净工作台（苏州净化工作台设备有限公司）;INCO108型二氧化碳培养箱（德国Memmert公司）;xMark型酶标仪（美国Bio-Rad公司）;L530R型低温离心机（湖南湘仪离心机有限公司）;D2060R型流式细胞仪（艾森生物有限公司）;CKX53型倒置相差显微镜（Olympus公司）。

1.2  方法

1.2.1  土田七醇提物的制备  称取洗净的土田七1 kg，粉碎过筛，75%乙醇加热回流提取3次，合并提取液，过滤浓缩，冷干成粉备用。

1.2.2  大孔树脂柱各洗脱部位的制备  称取D101大孔吸附树脂适量，预处理后，湿法装柱。将土田七醇提物用适量水溶解，上样。依次用水溶液、30%乙醇溶液、70%乙醇溶液、95%乙醇溶液进行洗脱。收集各洗脱液，并减压浓缩至干粉状。各乙醇洗脱部位以DMSO复溶后，制成0.1 g/mL（以提取物计）的原液，0.22 μm滤膜过滤，-20 ℃保存。

1.2.3  检测土田七各洗脱部位对肝癌细胞增殖的影响  取对数期生长的SMMC-7721细胞、HepG2细胞，调整细胞浓度为5×104/mL，每孔100 μL加入96孔板中，置于培养箱（37 ℃、5% CO2）中培养24 h。将细胞随机分组，姜黄素组和30%、70%、95%乙醇洗脱组分别设置5个不同给药浓度（20、40、60、80、100 μg/mL），同时设置阴性对照组（含细胞，加入等体积培养基）和空白对照组（不含细胞，只含培养基），每组复孔5个。加药后继续培养24 h。药物处理结束后，加入含10% CCK-8试剂的细胞培养基，混匀后置于培养箱中继续培养3 h，在450 nm波长下检测各培养孔的吸光度（A）值，并计算肝癌细胞的细胞活力[细胞活力=（A给药组-A空白组）/（A对照组-A空白组）×100%]。

1.2.4  肝癌细胞移植瘤小鼠模型的建立及分组给药

取对数期生长的SMMC-7721细胞悬液和HepG2细胞悬液，分别调整细胞浓度为1×106/mL，每只小鼠腹腔注射0.2 mL。培养5～7 d后，无菌条件下抽取小鼠腹水，调整细胞悬液浓度为2×106/mL，每只小鼠0.2 mL接种至右腿皮下部位。接种完成后，按随机原则将两种肝癌细胞的已成模小鼠各分为5组，每组6只。分组情况如下：空白对照组、姜黄素组及30%、70%、95%乙醇洗脱组。空白对照组给予生理盐水灌胃，0.5 mL/d;姜黄素组和各乙醇洗脱组给药剂量均为100 mg/（kg·d），连续灌胃给药14 d。给药结束后，完整剥离小鼠的皮下移植瘤，并称取肿瘤质量。

1.2.5  Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力  将基质胶用不含血清的培养基稀释，加入Transwell小室，于培养箱中静置1 h使基质胶凝固。取药物预先处理24 h的肝癌细胞，调整细胞浓度为2×105/mL，均匀接种至Transwell小室中。小室中加入600 μL的含血清培养基，培养24 h后，取出小室，清洗2～3次，用4%多聚甲醛固定细胞20 min，将小室浸泡在结晶紫染液中染色10 min，再次清洗并擦去上室内残留的细胞。晾干后，倒置显微镜下拍照，200倍下随机选取5个视野进行细胞计数。

1.2.6  划痕实验检测细胞迁移能力  取对数生长期的肝癌细胞制成细胞悬液，并接种于6孔板，每孔5×105个细胞，待细胞覆盖率达90%时，用10 μL 移液枪枪头垂直于孔板画线。用PBS清洗2～3次，洗掉悬浮的细胞。加入含有药物的培养基，在培养箱中继续培养，于0 h和24 h时，在倒置显微镜下观察并拍照。划痕面积=（0 h空白对照组划痕面积减号24 h 给药组划痕面积）/（0 h空白对照组划痕面积）×100%。81B6BDB6-19C0-43D4-894C-F1D425D6FF42

1.2.7  统计学分析  使用GraphPad Prism 7统计软件进行分析，计量资料数据以“x±s”表示，两组间的比较采用t检验。

2 结果

2.1  大孔树脂柱各洗脱部位抑制肝癌细胞增殖

测定各给药组的细胞活力，结果见图1。各洗脱部位中，70%乙醇洗脱组抑制肝癌细胞增殖的效果最佳，且存在显著的量效关系。70%乙醇洗脱组与姜黄素组相比较，差异无统计学意义（P>0.05），与30%、95%乙醇洗脱组相比较，存在显著性差异（P<0.01）。

2.2  大孔树脂柱各洗脱部位对小鼠移植瘤生长的影响

比较各给药组的瘤重，结果见图2。在SMMC-7721模型组中，70%乙醇洗脱组与空白对照组比较，平均瘤重有显著性差异（P=0.023 8）;95%乙醇洗脱组与空白对照组比较，平均瘤重有显著性差异（P=0.031 4）。在HepG2模型组中，70%乙醇洗脱组与空白对照组比较，平均瘤重有显著性差异（P=0.0324）;95%乙醇洗脱组与空白对照组比较，平均瘤重有显著性差异（P=0.038 8）。与空白对照组相比较，30%乙醇洗脱部位对小鼠的瘤重无明显影响。

2.3  土田七抗肝癌活性部位对肝癌细胞侵袭能力的影响

Transwell侵袭实验发现，用70%乙醇洗脱部位（20 μg/mL）处理肝癌SMMC-7721和HepG2细胞24 h后，与空白对照组相比，土田七能明显降低肝癌SMMC-7721和HepG2细胞侵袭的能力。详见图3。

2.4  土田七抗肝癌活性部位对肝癌细胞迁移能力的影响

划痕实验结果显示，与对照组相比，70%乙醇洗脱组（20 μg/mL）对肝癌SMMC-7721和HepG2细胞的迁移能力具有明显的抑制作用。在SMMC-7721模型组中，70%乙醇洗脱组与空白对照组比较，划痕面积有显著性差异（P=0.0385）。在HepG2模型组中，70%乙醇洗脱组与空白对照组比较，划痕面积有显著性差异（P=0.021 3）;详见图4。

3 讨论

临床上，手术治疗依然是提高肝癌治疗效果的主要手段，但除少数早期患者外，大部分患者因为肝癌细胞的转移而失去了手术机会。即便接受了手术治疗，在后期也有较大概率发生转移及复发，导致患者的5年存活率尚不及30%[15-20]。鉴于此，对能够抑制肝癌侵袭迁移的药物进行探索和研究具有重要的现实意义。本研究通过体内外抗肿瘤实验对土田七醇提物的大孔树脂洗脱部位进行了活性筛选，通过实验数据的分析，发现70%乙醇洗脱部位的抗肿瘤活性最佳，其次是95%乙醇洗脱部位，30%乙醇洗脱部位则无明显的抗肿瘤效果。因此，本实验以70%乙醇洗脱部位为基础，进一步探究其是否具有抑制肝癌细胞侵袭迁移的能力。为了排除药物通过诱导细胞凋亡对侵袭迁移的影响，此次采用了对肝癌细胞增殖率影响较小的药物浓度（20 μg/mL）进行了后续的Transwell侵袭实验和细胞划痕实验。实验结果表明，70%乙醇洗脱部位对两种人肝癌细胞株SMMC-7721和HepG2的侵袭迁移能力均具有显著的抑制作用。本研究为姜科植物土田七的开发利用和肝癌的临床治疗提供了实验依据和理论基础，随着研究的深入，土田七在肝癌的临床防治上将会有更广泛的作用。

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