微流控芯片环介导恒温扩增技术快速检测8种肠道致病菌*

宋 娜，刘朝阳，李梦蓝，王玉飞，杨晓莉，孙振学

解放军总医院第三医学中心检验科,北京 100039

肠道是致病菌定植和感染的主要器官[1]。肠道致病菌主要是通过污染的食物或水进入消化道，并最终定殖在肠道内引起感染性腹泻等疾病[2]。据统计，全球每年有17～50亿人发生腹泻，140万人因腹泻死亡[3-5]。志贺菌、沙门菌、副溶血性弧菌、弯曲菌、致泻型大肠埃希菌是引起腹泻的主要致病菌。因此，快速、准确、灵敏地检测出致病菌，对腹泻的临床诊断及用药有重要的指导意义。

微流控芯片环介导恒温扩增技术(LAMP)是一种新兴的分子诊断技术[6]，它将微流控芯片的微型化、高通量、低污染、低成本等优点与LAMP技术的简便、快捷、高灵敏度等优点相结合[7]，集成了一个新型的诊断技术。本文分别以志贺菌、沙门菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、肠聚集性大肠埃希菌、肠侵袭性大肠埃希菌、肠致病性大肠埃希菌、肠产毒素大肠埃希菌的特异性目的片段设计引物，利用微流控芯片LAMP技术，在反应体系中加入荧光染料EvaGreen，在恒温扩增过程中进行实时荧光监测，建立8种肠道致病菌同步检测的微流控芯片LAMP检测方法。现报道如下。

1 材料与方法

1.1菌株 实验所用标准菌株购自北京陆桥技术股份有限公司。具体菌株信息见表1。

表1 实验用菌株

1.2试剂与仪器 反应预混液(主要成分包括Bst DNA聚合酶、dNTPs、EvaGreen)；细菌裂解液(北京热景生物技术股份有限公司)；粪便提取试剂盒(北京热景生物技术股份有限公司)；肠道致病菌微流控芯片(北京热景生物技术股份有限公司)；微流控恒温扩增PCR多重核酸检测仪(北京热景生物技术股份有限公司)。

1.3方法

1.3.1引物设计与合成 本文使用的志贺菌、沙门菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、肠聚集性大肠埃希菌、肠侵袭性大肠埃希菌、肠致病性大肠埃希菌、肠产毒素大肠埃希菌基因组DNA引物均由北京热景技术股份有限公司提供。

1.3.2模板DNA的制备 吸取1 mL含有实验菌株的培养液，加入到1.5 mL无菌离心管中，10 000 r/min离心2 min，尽量弃除上清液；加入100 μL细菌裂解液悬浮菌体，95 ℃加热5 min，上清液即为待检测DNA模板。

1.3.3恒温扩增反应体系配制 恒温扩增反应体系为90 μL，包括10 μL待检测DNA模板、45 μL反应预混液、35 μL DNase/RNase-Free去离子水。

1.3.4微流控芯片LAMP反应 将恒温扩增反应体系加入肠道致病菌微流控芯片中，使用微流控恒温扩增PCR多重核酸检测仪进行恒温扩增。以1×104CFU/mL的福氏志贺菌、鼠伤寒沙门菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、大肠埃希菌混合菌液制备的基因组DNA为检测靶标测试扩增效率，以高压灭菌水作为反应条件特异性初筛模板，设置恒温扩增温度分别为60、63、65 ℃，反应时间30 min。

1.3.5微流控芯片LAMP特异度实验 提取福氏志贺菌、鼠伤寒沙门菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、大肠埃希菌、小肠结肠炎耶尔森菌、阪崎肠杆菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、长双歧杆菌、干酪乳杆菌的基因组DNA，采用1.3.3和1.3.4的反应体系和扩增方法进行扩增，以此来验证各个检测引物的特异性是否满足检测要求。

1.3.6微流控芯片LAMP灵敏度实验 用无菌生理盐水分别将福氏志贺菌、鼠伤寒沙门菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、大肠埃希菌的菌液稀释至1×106、1×105、1×104、 1×103、1×102CFU/mL，并进行平板菌落计数。然后再将上述菌液混合稀释至1×105、1×104、 1×103、1×102、1×101CFU/mL系列浓度，并分别对混合菌液的每个梯度进行模板DNA的制备，采用1.3.3和1.3.4的反应体系和扩增方法进行检测。

1.3.7模拟样本的检测 将福氏志贺菌、鼠伤寒沙门菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、大肠埃希菌的菌液混合，稀释至终浓度分别为1×105、1×104、1×103、1×102、1×101CFU/mL的混合致病菌菌液。取不同浓度的混合致病菌菌液1 mL分别加入黄豆粒大小的健康人粪便(约2.3 g)中，使用菌液将粪便悬浮混匀，4 ℃放置过夜，使细菌与粪便充分吸附，即为制备的模拟污染粪便样本。每个浓度制备3份模拟污染粪便样本，共制备15份，同时制备3份只加灭菌纯化水的未被污染的模拟粪便样本作为阴性对照。使用粪便提取试剂盒提取模拟粪便样本DNA，采用1.3.3和1.3.4的反应体系和扩增方法进行检测。

2 结 果

2.1反应温度优化 在恒温扩增反应体系中，温度不仅影响着扩增效率还直接关系着体系的特异性。温度高时特异性强，但引物不能与模板牢固结合，扩增效率下降；温度低时产量高，但可能造成引物与模板错配，产生非特异性产物。因此，在保证特异性的前提下为了提高扩增效率，需要对恒温扩增反应体系进行温度优化，以选取最佳的反应条件。综合8种肠道致病菌，在65 ℃条件下，扩增效率最佳，检出时间(CT)最短，且无非特异扩增产物。这表明在相同的时间内，恒温扩增反应体系在65 ℃条件下有着更多的特异性产物，更有利于检测。见表2。

表2 反应温度优化结果(min)

2.2微流控芯片LAMP特异性分析 本研究分别将1.3.5提取的各菌液基因组DNA作为检测模板，配制成恒温扩增反应体系并加入肠道致病菌微流控芯片中进行恒温扩增，结果显示，福氏志贺菌的基因组DNA在反应孔2和10中显示阳性，在其他反应孔中均为阴性；鼠伤寒沙门菌的基因组DNA在反应孔3和10中显示阳性，在其他反应孔中均为阴性；副溶血性弧菌的基因组DNA在反应孔4和10中显示阳性，在其他反应孔中均为阴性；空肠弯曲菌的基因组DNA在反应孔5和10中显示阳性，在其他反应孔中均为阴性；大肠埃希菌的基因组DNA在反应孔6～10显示阳性，在其他反应孔中均为阴性；小肠结肠炎耶尔森菌的基因组DNA、阪崎肠杆菌的基因组DNA、单核细胞增生李斯特菌的基因组DNA、金黄色葡萄球菌的基因组DNA、铜绿假单胞菌的基因组DNA、肺炎克雷伯氏菌的基因组DNA、粪肠球菌的基因组DNA、长双歧杆菌的基因组DNA、干酪乳杆菌的基因组DNA，均只有反应孔10显示阳性，在其他反应孔中全部为阴性。以上结果说明8项致病菌的反应体系均未与其他细菌出现交叉反应，特异性好，同时也说明芯片的密闭性良好，各反应孔之间独立，无交叉反应。说明建立的8种肠道致病菌微流控芯片LAMP能够为临床诊断提供可靠依据。

2.3微流控芯片LAMP灵敏度分析 为验证LAMP对8种肠道致病菌的灵敏度，将提取的1×105、1×104、 1×103、1×102、1×101CFU/mL的混合菌液基因组DNA进行微流控芯片LAMP扩增。结果显示，混合菌液浓度在1×102CFU/mL及以上时8种致病菌的荧光值均逐渐增强直至扩增完成，发生扩增反应，即该方法对福氏志贺菌、鼠伤寒沙门菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、肠聚集性大肠埃希菌、肠侵袭性大肠埃希菌、产肠毒素大肠埃希菌、肠致病性大肠埃希菌的最低检测限均为100 CFU/mL；并且随着混合菌液浓度的降低，引物与模板接触的可能性减少，导致反应所需时间变长；当混合菌液浓度为1×101CFU/mL时，因浓度太低与引物结合失败而无法完成扩增反应。

2.4模拟粪便样本检测 模拟粪便样本中各致病菌的浓度分别为 1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、0 CFU/mL，提取基因组DNA后检测。本实验建立的微流控芯片LAMP对模拟粪便样本中福氏志贺菌、鼠伤寒沙门菌、副溶血性弧菌、肠侵袭性大肠埃希菌、肠致病性大肠埃希菌、肠产毒素大肠埃希菌的最低检出限为100 CFU/mL；对空肠弯曲菌和肠聚集性大肠埃希菌的最低检出限为1 000 CFU/mL，同时对灭菌纯化水处理的粪便未检出上述致病菌。对模拟粪便的检测结果表明，微流控芯片LAMP能够成功检测粪便中的致病菌，且与对菌液的检测时间一致，最快可在10 min内获得阳性判定结果，而对于最低检出限浓度的粪便样本，在30 min内获得阳性判定结果，整个过程不超过30 min。见表3。

表3 不同浓度模拟粪便样本中各致病菌CT检测结果(min)

3 讨 论

无论在发达国家还是发展中国家，急性腹泻仍然是一个严重的公共卫生问题[8]。志贺菌、沙门菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、肠聚集性大肠埃希菌、肠侵袭性大肠埃希菌、肠致病性大肠埃希菌、产肠毒素大肠埃希菌是肠道感染的常见致病菌，能够经过消化道传播，引起局部暴发流行[9-10]。所以，亟需一种快速、准确、灵敏、便捷的检测手段，用于检测粪便样本中的肠道致病菌群，预防疾病流行，并有效指导抗菌药物的使用。

本研究通过优化传统的LAMP检测方法，建立多通道微流控芯片LAMP，并采用对扩增反应抑制较小的EvaGreen荧光染料来进行实时荧光监测，实现了8种重要肠道病原体快速、特异、灵敏和一体化检测。检测结果显示，志贺菌、沙门菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、肠聚集性大肠埃希菌、肠侵袭性大肠埃希菌、肠致病性大肠埃希菌、产肠毒素大肠埃希菌共8种致病菌可通过同一张芯片同时检测。所需试剂量少，且微流控芯片LAMP无须进行变性、退火、延伸等复杂步骤即可实现扩增，与实时荧光定量PCR方法需要昂贵、精密实验仪器相比，反应成本低。同时，微流控芯片LAMP技术，灵敏度较高，芯片中8种致病菌的检测灵敏度均为100 CFU/mL，比传统LAMP方法灵敏度高出10倍左右[11]。在模拟粪便样本中，福氏志贺菌、鼠伤寒沙门菌、副溶血性弧菌、肠侵袭性大肠埃希菌、肠致病性大肠埃希菌、产肠毒素大肠埃希菌的最低检出限均为100 CFU/mL，空肠弯曲菌和肠聚集性大肠埃希菌的最低检出限为1 000 CFU/mL，优于多重PCR检测方法[12-13]。此外，这8种致病菌的扩增检测可以在30 min之内判定结果，比大部分相同灵敏度水平的分子生物学快速检测方法用时短[14-15]。

本研究针对志贺菌、沙门菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、肠聚集性大肠埃希菌、肠侵袭性大肠埃希菌、肠致病性大肠埃希菌、产肠毒素大肠埃希菌的保守基因分别设计了一套特异性引物，使其适合于该8种致病菌的核酸诊断。此外，微流控芯片LAMP实现了全封闭操作，避免了气溶胶的污染[16-17]。同时，在微流控芯片上还设置了内参对照，可以监控实验过程是否正常，实现了扩增反应体系的全封闭化和微量化，从而避免了人员操作造成的人为实验污染，大大提高了检测的准确性和特异度[12,18-19]。

综上所述，针对志贺菌、沙门菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、肠聚集性大肠埃希菌、肠侵袭性大肠埃希菌、肠道致病性大肠埃希菌、产肠毒素大肠埃希菌设计引物并建立微流控芯片LAMP，可应用于粪便样本检测。8种致病菌均能在30 min内获得阳性判定结果，且检测灵敏度可达100 CFU/mL。模拟粪便样本中福氏志贺菌、鼠伤寒沙门菌、副溶血性弧菌、肠侵袭性大肠埃希菌、肠致病性大肠埃希菌、产肠毒素大肠埃希菌的最低检测限可达100 CFU/mL；空肠弯曲菌和肠聚集性大肠埃希菌的最低检出限为1 000 CFU/mL，说明微流控芯片LAMP具有用时短、反应快、特异度和灵敏度高且操作简单等特点，从而使病原微生物床旁检测(POCT)成为可能。