梁王茶水提物急性毒性评价

赵春燕，龚加顺，王秋萍

（云南农业大学食品科学技术学院，云南昆明 650201）

关键字：梁王茶；水提物；急性毒性；安全评价

梁王茶属（Nothopanax Miq.）又名山槟榔、树五加等，系五加科（Araliaceae）无毛刺灌木或乔木，无皮刺，其叶形单叶或掌状复叶，叶柄细长，无托叶[1,2]。 我国主要有2种即异叶梁王茶[Nothopanax davidii(Franch.) Harms ex Diels]和掌叶梁王茶[N.delavayi (Franch.) Harms ex Diels][3,4]。

梁王茶具有较高的药用价值[5]，常被人们当作时蔬食用，如在阳宗境内有着“茶不泡水当道菜”[1]。梁王茶嫩茎叶不仅可作为蔬菜食用[6]，还可制成梁王茶干叶泡水喝[7]，其树皮被用来提取栲胶，树叶常被用来驱杀害虫[7]。梁王茶作为药用材料时，有清热、祛风除湿药活络、治疗喉咙肿痛等作用[8,9]。另据报道，梁王茶多糖也有较好的双向免疫调节、抗氧化应激和抗炎症的生理活性作用[10]。

梁王茶的化学成分组成和提取是目前研究较多的一个方面。杨青等[3]使用色谱法首次从掌叶梁王茶茎皮中分离出了三对节酸和原儿茶酸等化合物，这些化合物被报道具有较好的生理活性作用。庾石山等[11-15]从异叶梁王茶甲醇提取物中分离出八种五环三贴皂苷单体，从树皮醇提物中分离得到异叶梁王茶苷Ⅶ和Ⅷ、梁王茶苷Ⅱ及五种新的Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ和Ⅺ梁王茶苷化合物。缪明志等[10]研究了不同部位掌叶梁王茶多糖的含量分布，发现可溶性多糖含量分布在根部最高，可达1.68%。洪化鹏等[16]在研究异叶梁王茶鲜叶蒸馏精油的过程中，发现其精油主要包含月桂烯等化合物。赵春燕等[17]检测了掌叶梁王茶叶中黄酮、多酚等组分的含量，并对其抗氧化能力进行了检测，发现茶粉的抗氧化能力强于水提物。

上述研究表明梁王茶含有较多种类的萜类化合物及其他活性成分，有着较高药用价值，但是对于梁王茶的毒理学研究尚无报道，为进一步开发及挖掘梁王茶的价值，有必要对其毒理学进行研究。因此，本研究对梁王茶的急性毒性采用LD50评价方法进行初探，以对梁王茶产业的发展提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

掌叶梁王茶由兰坪润民农产品有限责任公司提供，将掌叶梁王茶叶制成干叶备用。

ALT、AST、URE、CREA试剂盒，迈克生物股份有限公司。3100全自动生化分析仪，日本株式会社日立制作所。

1.2 方法

1.2.1 梁王茶水提物的制备

梁王茶与水的比例为1 g:10 mL，沸水浸提30 min，过滤得到滤液。按上述条件重复浸提一次，合并两次滤液，在60 ℃减压浓缩，浓缩液真空冷冻干燥得到梁王茶水提物备用。真空冷冻干燥得到的梁王茶水提物主要由水溶性总糖236.05 g/kg、水溶性蛋白质99.47 g/kg、水溶性氨基酸30.83 g/kg、总多酚27.08 g/kg、水溶性多糖17.99 g/kg、总黄酮2.03 g/kg等化学组分组成[17]。

1.2.2 实验动物

SPF级昆明种小鼠，雌雄各半，体重20±2 g，购于昆明医科大学（SCXK(滇)2015-0002）。基础饲料喂养，自由饮水和摄食，12 h昼夜交替、环境温度20±2 ℃，相对湿度40%～70%。

1.2.3 正式实验

参照《食品国家安全标准急性经口毒性试验》[18]霍恩氏法进行预实验。根据预实验结果，小鼠未出现死亡，存活率达100%，无法得出0%和100%的估计致死量（Dn，Dm）。因此采用限量法进行经口急性毒性实验。84只小鼠（雌雄各半）设置为6个剂量组（15000、

10500、7350、5145、3601.5、2521 mg/kg·bw，n=12）和一个空白对照组（Control，n=12），组间剂量比为1:0.7，灌胃体积为30 mL/kg。给药时空白对照组给予同体积的蒸馏水。给药前小鼠自由饮水，禁食4～6 h，给药3 h后恢复投食，于给药后1、2、4、6 h密切观察小鼠体征，此后每天1次，连续观察14 h并记录小鼠活动状况、体征、中毒及死亡情况。于14 h观察期后牺牲老鼠，解剖并观察各器官的情况，并对心、肝、脾、肺、肾脏进行称重，计算脏器系数。采用全自动生化分析仪进行谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、肌酐（URE）、尿素（CREA）生化指标的测定。

1.3 统计分析

数据以平均值±标准差表示，使用Grubbs检验数据排除过失误差；采用SPSS 19.0软件对合格数据进行显著性分析，采用GraphPad Prsim 8.0作图。

2 结果与讨论

2.1 梁王茶水提物对雌雄小鼠死亡率的影响

不同剂量梁王茶水提物对雌性和雄性小鼠死亡率的影响如表1所示，其中每组12只小鼠，雌雄各六只。给予雌雄小鼠分别灌胃2521、3601.5、5415、7350、10500、15000 mg/kg·bw梁王茶水提物，小鼠死亡率均为0%，说明梁王茶水提物不会引起小鼠死亡。

表1 不同剂量梁王茶水提物对雌雄小鼠死亡率的影响 Table 1 Effect of LWC water extract on the death rate of female and male mice

2.2 梁王茶水提物对雌雄小鼠中毒表现的影响

给予小鼠不同剂量梁王茶水提物后，在14 d观察时间内，雌雄小鼠均未出现异常行为，分泌物、体温、呼吸情况、皮肤毛被等正常，未见任何中毒症状（见表2）。由此可见梁王茶水提物不会引起受试动物的中毒反应，其LD50值大于15000 mg/kg·bw，根据WHO1977年颁布的毒性分级标准[19]，梁王茶水提物属实际无毒级物质。

表2 梁王茶水提物对雌雄小鼠中毒表现的影响 Table 2 Effect of LWC water extract on poisoning manifestations of female and male mice

2.3 梁王茶水提物对小鼠体重的影响

灌胃不同剂量梁王茶水提物对雌雄小鼠体重的影响见表3。由表可知，给予雌雄小鼠不同剂量（2521～15000 mg/kg·bw）的梁王茶水提物，其体重与对照组无显著性差异（p＞0.05），说明梁王茶水提物对雌雄小鼠体重无影响。

表3 不同剂量梁王茶水提物对雌雄小鼠体重的影响 Table 3 Effects of LWC water extract on the body weight of female and male mice

2.4 梁王茶水提物对小鼠主要脏器系数的影响

梁王茶水提物对雌雄小鼠主要脏器系数的影响见图1。如图1所示，给予雌性小鼠不同剂量梁王茶水提物后，各剂量组心脏系数与对照组相比无显著性差异（p＞0.05），说明梁王茶水提物对雌性小鼠心脏无影响。肝脏则是身体内代谢主器官，在机体中有去氧化、储存肝糖原、分泌性蛋白质的合成以及解毒等作用[20,21]。肝脏也可转化来自体内和体外的许多非营养性物质如各种药物以及体内某些代谢产物，并通过新陈代谢的方式彻底分解或以原形将这些物质排出体外[22,23]。与对照组相比，灌胃2521～10500 mg/kg·bw梁王茶水提物对雌性小鼠肝脏系数均无显著影响（p＞0.05），最高剂量组（15000 mg/kg·bw）肝脏系数显著低于对照组（p＜0.05）。给予2521～15000 mg/kg·bw梁王茶水提物对雌性小鼠脾脏系数均无显著影响（p＞0.05），最高剂量组（15000 mg/kg·bw）雌鼠的脾脏系数降低，但无显著性差异（p＞0.05），有研究表明鼠脾脏系数降低可能是由于免疫抑制作用引起的[24]。灌胃2521～15000 mg/kg·bw梁王茶水提物后，雌鼠的肺脏系数增加，但与对照组相比均无显著差异（p＞0.05），表明梁王茶水提物对雌性小鼠肺脏无影响。肾脏主要有排泄体内代谢产物和过滤除去体内的有害物质的作用，肾脏功能的紊乱会放大有毒物质对机体的毒害程度[25]。给予雌性小鼠2521、3601.5 mg/kg梁王茶水提物，其肾脏系数与正常小鼠相比无显著性差异（p＞0.05），但灌胃更高剂量（5415、7350、10500、15000 mg/kg）时，雌性小鼠的肾脏系数显著高于对照组（p＜0.05），表明梁王茶水提物对雌性小鼠的肾脏产生损伤。

脏器系数一方面可以反映动物内脏器官的功能状态，也可应用于毒性试验和安全评价中，为相应的模型比较提供参考[26,27]。

如图1所示，给予雄性小鼠不同剂量梁王茶水提物后，2521 mg/kg·bw的心脏系数与对照组相比无显著差异（p＞0.05），其他剂量组（3601.5～15000 mg/kg·bw）心脏系数显著低于对照组（p＜0.05），表明梁王茶水提物对雄性小鼠心脏呈现一定毒性作用。灌胃2521～5145 mg/kg·bw梁王茶水提物对雄性小鼠的肝脏系数无显著影响（p＞0.05），其中剂量为7350 mg/kg·bw时，呈现显著性差异（p＜0.05），剂量为10500 mg/kg·bw时，梁王茶水提物对雄性小鼠的肝脏系数无显著影响（p＞0.05），这可能是小鼠个体差异造成的误差。剂量为15000 mg/kg·bw时，雄鼠肝脏系数显著高于对照组（p＜0.05）。给予2521～15000 mg/kg·bw王茶水提物，各剂量组雄鼠脾脏系数均显著高于对照组（p＜0.05），说明梁王茶水提物对雄鼠脾脏呈现一定毒性作用。灌胃2521～15000 mg/kg·bw梁王茶水提物，各剂量组雄鼠的肺和肾脏系数与对照组相比均无显著差异（p＞0.05），说明梁王茶水提物对雄性小鼠的肺和肾脏没有毒性作用。

2.5 梁王茶水提物对小鼠血液生化指标的影响

ALT是临床上用于诊断病毒性肝炎、中毒性肝炎的重要指标，大量存在于肝细胞的细胞质中时会诱导以上疾病发生，而AST则主要存在于肝脏和心脏两个机体主要的器官内[28,29]。正常时血清中AST的含量较低，但是肝脏和肾脏内相应细胞受损时，其含量在血清中的浓度升高[30]。肌酐在衡量肾功能好坏时具有重要的意义，是肌肉在机体内代谢的产物[31]。

如图2所示，给予不同剂量梁王茶水提物对雌雄小鼠血液生化指标的影响如图2所示。灌胃2521～ 10500 mg/kg·bw梁王茶水提物对雌鼠血清中的ALT（谷丙转氨酶）、AST（谷草转氨酶）、CREA（肌酐）水平均无显著影响（p＞0.05）。给予2521～5145 mg/kg·bw梁王茶水提物，雌鼠血清UREA（尿素）含量与对照组无显著差异（p>0.05）；灌胃剂量为7350 mg/kg·bw与10500 mg/kg·bw时，雌鼠血清尿素含量显著高于对照组（p＜0.05），这与肾脏系数结果一致，说明灌胃极高剂量梁王茶水提物对雌鼠肾脏表现出轻微毒性，可能是超出了雌鼠肾脏的负担能力。

给予雄鼠不同剂量梁王茶水提物，其血清ALT水平与对照组无显著差异（p＞0.05）。与对照组相比，梁王茶水提物组雄鼠血清AST水平呈降低趋势，且剂量为5145 mg/kg·bw和15000 mg/kg·bw时，AST水平显著低于对照组（p＜0.05），这与雄鼠心脏、肝脏系数结果一致，与对照组比较发生了显著性变化（p＜0.05）。雄鼠血清尿素水平与梁王茶水提物剂量呈正相关趋势，且剂量为5145、7350、10500 mg/kg·bw时，雄鼠血清UREA水平显著高于对照组（p＜0.05）。雄鼠血清CREA水平随剂量增加而降低，且剂量为5145、10500、15000 mg/kg·bw时，雄鼠血清CREA水平显著低于对照组（p＜0.05）。

本研究发现，灌胃高剂量梁王茶水提物（≥5145 mg/kg·bw）会引起雄鼠血清AST和肌酐显著降低（p＜0.05），然而这两项指标的降低在临床上无明显意义。尿素可由肾小球滤过而排出体外，也是临床上用于评估肾功能的重要指标之一，从图2可看出，给予雌鼠高剂量（≥7350 mg/kg·bw）和雄鼠高剂量（≥5145 mg/kg·bw）梁王茶水提物，血清尿素水平显著上升（p＜0.05），表明极高剂量梁王茶水提物对雌雄小鼠肾脏均有一定毒性。

3 结论

急性毒性研究表明，梁王茶水提物属于实际无毒物质，其LD50＞15000 mg/kg·bw。梁王茶水提物对雌鼠和雄鼠体重增量无显著影响（p＞0.05）。与对照组相比，给予雌鼠2521～15000 mg/kg·bw梁王茶水提物，对其心脏、脾脏和肺脏系数、血清ALT、AST和肌酐水平均无显著影响（p＞0.05）；灌胃高剂量梁王茶水提物，雌鼠的肝脏系数（剂量≥15000 mg/kg·bw）显著降低（p＜0.05），肾脏系数（剂量≥5145 mg/kg·bw）和尿素水平（剂量≥7350 mg/kg·bw）显著升高（p＜0.05）。与对照组相比，给予雄鼠2521～15000 mg/kg·bw梁王茶水提物，对其肺脏和肾脏系数、血清ALT水平均无显著影响（p＞0.05）；灌胃高剂量梁王茶水提物，雄鼠的心脏系数（剂量≥3601.5 mg/kg·bw）、血清AST（剂量≥5145 mg/kg·bw）和肌酐（剂量≥5145 mg/kg·bw）水平显著降低（p＜0.05），和脾脏系数（剂量≥2521 mg/kg·bw）及尿素水平（剂量≥5145 mg/kg）显著升高（p＜0.05）。极高剂量梁王茶水提物对雌性（剂量≥5145 mg/kg·bw）小鼠肾脏有一定毒性。极高剂量梁王茶水提物对雄性（剂量：7350 mg/kg·bw、15000 mg/kg·bw）对小鼠肝脏有一定毒性。