γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp改善斑马鱼焦虑样行为及五羟色胺合成的作用机制

朱西平，崔春，王炜，王顺民，陶瑾，郭玉峰

（1.安徽工程大学生物与食品工程学院，安徽芜湖 241000）（2.华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州 510640）（3.广东巍微生物科技有限公司，广东广州 510640）

焦虑症（Anxiety disorders）又名焦虑性神经症，是当今世界上最为常见的全球性精神卫生问题之一，严重影响着人们的生活质量[1,2]。目前关于焦虑症的发病机制涉及以下几种假说：神经递质假说、免疫系统假说、HPA轴假说、脑源性神经营养因子假说、遗传学假说等[3,4]。其中单胺类神经递质五羟色胺（5-HT）分泌异常在精神类疾病的诊断和治疗中扮演着非常重要的角色，是目前最为公认的发病机制假说之一[5]。研究表明合成和分泌5-HT的中枢神经系统与调节情绪的脑区（如海马、前额叶皮层）有着密切的突触联系，构成了单胺类神经递质5-HT参与精神类疾病调节的生理基础[6]。近几年越来越多的学者开始关注5-HT在焦虑障碍中所发挥的作用，此外临床上用于治疗焦虑症的药物的作用机制和靶点也多数是通过调节突触间隙神经递质5-HT的水平来发挥作用[7-9]，但是这些药物均具有其自身的局限性（用药时间长、起效慢、副作用明显、复发率高和症状缓解不彻底等特点），其作用机理也有待进一步明确[10]。随着人们对生活质量的要求越来越高，单纯通过药物调节中枢神经系统5-HT水平的治疗已经无法满足人们的需求，因此营养干预在精神类疾病中的作用越来越受到重视。

色氨酸（Trp）是5-HT合成的直接前体物质，5-HT又是抑制大脑产生焦虑情绪的神经递质，因此膳食补充Trp及其衍生物可增加机体Trp浓度进而提高5-HT的水平[11]。流行病学和临床研究表明，Trp及其衍生物营养干预能够有效降低精神类疾病的发病率，并且有学者建议Trp可作为改善精神健康的饮食进行补充[12-15]。由于Trp肽比Trp具有更优的吸收机制和更强的生物活性，近几年Trp肽营养干预在精神类疾病中的研究不断增加，Orosco等[13]和Zhu等[14,15]研究表明通过膳食补充乳清蛋白源色氨酸寡肽可增加实验动物中枢神经系统5-HT的释放，具有抗焦虑的作用。γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp已被证明具有改善焦虑性抑郁症小鼠的焦虑样行为作用，但是关于其改善斑马鱼焦虑样行为的研究尚处于空白。γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp是以谷氨酰胺（Glutamine，Gln）和Trp为反应底物在解淀粉芽孢杆菌源L-谷氨酰胺酶（L-Glutaminase）的催化下定向合成的系列产物，由γ-Glu-Trp、γ-[Glu]2-Trp、γ-[Glu]3-Trp 和γ-[Glu]4-Trp四种寡肽组成[15]，但是关于γ-Glu-Trp、γ-[Glu]2-Trp、γ-[Glu]3-Trp和γ-[Glu]4-Trp分别作用改善和预防焦虑症的研究尚处于空白。因此，本文以γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp、γ-Glu-Trp、γ-[Glu]2-Trp、γ-[Glu]3-Trp和γ-[Glu]4-Trp为供试品，利用斑马鱼模式生物研究其改善焦虑样行为和促进5-HT合成的作用，再结合生化指标探究其改善焦虑症的作用机制，筛选出改善焦虑效果最优的肽单体。旨在为γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽单体预防和改善焦虑症的作用机制提供方法指导和理论依据，这些研究对促进γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽单体的未来实际应用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

成年斑马鱼（野生型AB品系），♀ ♂比为1:1，2月龄由华南理工大学医学院斑马鱼实验室培育；解淀粉芽孢杆菌源L-谷氨酰胺酶（100 U/g）购买于天野酶中国有限公司（中国上海）；L-色氨酸和L-谷氨酰胺两种氨基酸（纯度≥95%）购买于上海伯奥生物科技有限公司（中国上海）；γ-Glu-Trp（γ-EW）、γ-[Glu]2-Trp（γ-EEW）、γ-[Glu]3-Trp（γ-EEEW）、γ-[Glu]4-Trp（γ-EEEEW）（纯度≥95%）四种商业合成色氨酸肽单体均由南京肽业生物科技有限公司（中国南京）合成；解剖剪、镊子、铝箔纸、一次性过滤器、研钵、离心管、移液器等均购于广州精科化玻仪器公司（中国广州）；生化指标测定所需的试剂盒均购买于上海江莱生物科技有限公司（中国上海）。

1.2 实验方法

1.2.1 γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp的制备

酶法定向合成γ-谷氨酰色氨酸肽（γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp，EnW）的方法参照Yang等[16]，稍有改进。以Gln为酰基供体、Trp为酰基受体、Gln:Trp=300 mmol/L:100 mmol/L、底物浓度为0.2 mol/L、酶添加量为0.15%（m/V）在37 ℃和pH 10.0的条件下利用解淀粉芽孢杆菌源L-谷氨酰胺酶催化反应180 min。然后利用沸水浴的方法灭酶处理15 min以终止反应，冷冻干燥，-20 ℃保存，待用。采用UPLC-ESI-MS/MS对整个反应产物进行序列和结构鉴定，UPLC-ESI-MS/MS相关参数设定如下：干燥气温度180 ℃、流速8.0 L/min；扫描范围质荷比（m/z）50～1000；毛细管电压4500 V；四级杆电子能量为4.0 eV，碰撞诱导裂解能为8.0 eV。采用电喷雾离子源ESI+模式下扫描，ESI+雾化器压力为1.5 bar；采用Data analysis 4.1软件对原始数据进行手动de novo分析得到反应产物中多肽序列，测定的多肽实际分子质量应与其理论值相匹配，偏差在300×10-6以内，然后根据Yang等[17]采用离子峰萃取的方法对鉴定的系列产物进行定量分析。

1.2.2 供试品的最大耐受浓度（MTC）测定

斑马鱼饲养在华南理工大学医学院斑马鱼实验室，参照王丽娟[18]的方法进行，并有所改进。供试品的最大耐受浓度（MTC）测定方案经华南理工大学斑马鱼实验室批准，并遵循中国试验动物护理和使用指南。EnW、γ-EW、γ-EEW、γ-EEEW、γ-EEEEW五个供试品均按照不同的浓度分为6个组（一个正常组和5个浓度梯度组），共计30个组别，每组30尾斑马鱼，然后随机选取900尾斑马鱼于6孔板中（温度28.5±0.2 ℃、pH值7.5±0.02）开始供试品最MTC测定。上述供试品（EnW、γ-EW、γ-EEW、γ-EEEW、γ-EEEEW）均按照如下浓度梯度测试：0、125、250、500、1000和2000 μg/mL。供试品处理24 h后，观察斑马鱼状态，记录并统计各实验组斑马鱼的毒性情况与死亡数量，确定上述五种供试品的MTC。

1.2.3 动物分组

依据1.2.2的结果得到EnW、γ-EW、γ-EEW、γ-EEEW、γ-EEEEW的MTC，选取各供试品的MTC和1/9 MTC为实验的高剂量组和低剂量组，同时设置一个正常对照组，共计11个组别，每个组30尾斑马鱼。330尾斑马鱼（温度28.5±0.2 ℃、pH值7.5±0.02、鱼缸容积3 L、14/10 h光暗循环，电导率450～550 μs/cm；系统水为循环水，每日自动更新10%，并有紫外灯实时净水消毒），利用斑马鱼独立养殖系统养殖斑马鱼，每日喂食两次，食物为丰年虾卵。试验方案经华南理工大学斑马鱼实验室批准，并遵循中国试验动物护理和使用指南。330尾斑马鱼随机分为11组，分别为正常对照组（NC）；EnWL（EnW低剂量组56 μg/mL）、EnWH（高剂量组500 μg/mL）；γ-EWL（γ-EW低剂量组56 μg/mL）、γ-EWH（γ-EW高剂量组500 μg/mL）；γ-EEWL（γ-EEW低剂量组56 μg/mL）、γ-EEWH（γ-EEW高剂量组500 μg/mL）；γ-EEEWL（γ-EEEW低剂量组56 μg/mL）、γ-EEEWH（γ-EEEW高剂量组500 μg/mL）；γ-EEEEWL（γ-EEEEW低剂量组56 μg/mL）、γ-EEEEWH（γ-EEEEW高剂量组500 μg/mL）。供试品处理前将斑马鱼移入一个3 L的鱼箱中适应3 d，适应期结束后供试品处理14 d。每天供试品处理时将实验斑马鱼从饲养鱼缸中捞出，放入浸有相对浓度 供试品的鱼水中，浸泡30 min，然后再转入饲养鱼缸中。在第15 d供试品处理结束后一天将受试斑马鱼放入干净的测试鱼箱中，进行行为学测试。

1.2.4 行为学实验

供试品以水溶给药的方式处理14 d后，在白天（早7:00～晚17:00）对所有实验组斑马鱼进行焦虑样行为测试。为了确保获得准确的结果必须使整个行为学测试过程在一个安静和平稳的环境下进行，此外，且整个测试过程中保持水温、水质与正常饲养条件一致。

1.2.4.1 黑白偏好实验

黑白偏好实验模型为长×宽×高（18 cm×9 cm×7 cm）的鱼箱，通过可控式隔板把鱼箱分为两个相等的部分，一侧四周均被黑色包绕，另一色则被白色包绕。斑马鱼黑白偏好实验根据蒋湘云[19]报道的方法，并有所改进，供试品处理14 d后，将正常饲养鱼水（温度28.5±0.2 ℃、pH值7.5±0.02）装入黑白偏好实验测试装置中，水深约3～4 cm，并保证斑马鱼能在整个测试过程中自由游动。实验开始前，先将受试鱼转移至行为学检测所用场地，并给予受试鱼30 min时间来适应周围环境。测试开始时，首先将斑马鱼轻柔且迅速的放入明区，然后打开阀门，点击开始按钮，开始一个6 min的测试。整个测试过程中采用Zebralab 3.3斑马鱼行为轨迹分析仪（法国Viewpoint公司）系统跟踪和记录斑马鱼的运动和行为。试验结束后，将斑马鱼从水中取出并放回饲养鱼缸中。整个实验采集数据，再分析斑马鱼在明区的停留时间，计算明区停留时间百分比见公式（1）。

1.2.4.2 新鱼缸实验

新鱼缸实验模型为底面长×宽×高×顶面长（22.5 cm×7.1 cm×15.2 cm×27.9 cm）的梯形鱼箱，将新鱼缸装上鱼水，水面距离上顶面约2～3 cm。将斑马鱼从饲养鱼缸缸转移至测试新鱼缸中，测试过程中光照强度与平时饲养条件相同，实验开始前，先将受试鱼转移至行为学检测所用场地，并给予受试鱼30 min时间来适应周围环境。适应结束后点击开始按钮，开始一个6 min的测试。整个测试过程中采用Zebralab 3.3斑马鱼行为轨迹分析仪（法国Viewpoint公司）系统跟踪和记录斑马鱼的运动和行为。试验结束后，将斑马鱼从水中取出并放回饲养鱼缸中。整个实验采用先采集数据，后分析斑马鱼6 min内在新鱼缸中的上下穿梭次数和鱼缸上半部分停留时间百分比。

1.2.5 生化指标测定

行为学结束后，立即在冰上快速分离受试斑马鱼脑组织，用4 ℃的生理盐水冲洗3～5次后用吸水纸吸干斑马鱼脑组织，再加入9倍体积的磷酸盐缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS），然后用均质仪将组织样品匀浆，最后4 ℃、3000 r/min离心20 min取上清液，将上清液分装后，-80 ℃保存，待用。斑马鱼脑组织中Trp浓度、TPH活性、吲哚胺-2,3-双加氧酶（Indoleamine2,3-dioxygenase，IDO）活性、犬尿氨酸（Kynurenine，KYN）和5-HT水平等生化指标测定根据试剂盒说明书采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（Elisa）方法。整个测定方法简述如下：首先将试剂盒取出室温（25±2 ℃）平衡20 min，往包被单抗的微孔中分别依次加Trp、TPH、IDO、KYN和5-HT，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺显色，然后用分光光度法在450 nm波长下测定OD值，根据OD值计算斑马鱼脑组织中Trp浓度、TPH活性、IDO活性、KYN和5-HT水平。

1.2.6 数据处理

实验数据采用Excel、OriginPro 8.5.1、SPSS 17.0（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）等统计分析软件进行分析和作图；所有实验均重复三次并采用“平均值±标准偏差”的形式来表示。多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）和两两比较采用Duncan’s post-hoc检测，p＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 酶促反应体系中γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp的表征特性

为进一步探究以Gln为供体、Trp为受体，在解淀粉芽孢杆菌源L-谷氨酰胺酶催化作用下获得的酶促反应液，采用UPLC-ESI-MS/MS对酶促反应液进行定性定量分析和结构鉴定。原始数据通过Data analysis 4.1软件中的手动de novo分析后，结果如表1所示。从该酶促反应液中共鉴定出四种γ-谷氨酰肽：γ-Glu-Trp、γ-[Glu]2-Trp、γ-[Glu]3-Trp、γ-[Glu]4-Trp。在正离子[M+H+]模式中质核比（m/z）为334.14、463.18、592.22、721.27分别对应多肽γ-Glu-Trp、γ-[Glu]2-Trp、γ-[Glu]3-Trp、γ-[Glu]4-Trp的理论m/z（334.14、463.18、592.22、721.27）（Error≤300×10-6）。然后采用离子峰萃取的方法对γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp酶促反应 液 中γ-Glu-Trp、γ-[Glu]2-Trp、γ-[Glu]3-Trp、γ-[Glu]4-Trp进行定量分析，分析结果可知γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp的总转化率达到45.72%（m/m），其中γ-Glu-Trp、γ-[Glu]2-Trp、γ-[Glu]3-Trp、γ-[Glu]4-Trp的产率分别为30.82%、10.36%、3.51%和1.03%（m/m）。综上所述，以Gln为酰基供体、Trp为酰基受体，在L-谷氨酰胺酶催化作用下能够定向合成γ-Glu-Trp、γ-[Glu]2-Trp、γ-[Glu]3-Trp、γ-[Glu]4-Trp系列产物，从分析结果来看，该酶促合成方法中γ-Glu-Trp和γ-[Glu]2-Trp合成率较高。

表1 酶促反应体系中γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp的表征特性 Table 1 The characterization of identified γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp in the reaction system

2.2 γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽单体的最大耐受浓度

EnW、γ-EW、γ-EEW、γ-EEEW、γ-EEEEW设置的浓度分别为0、125、250、500、1000和2000 μg/mL。供试品处理24 h后，观察斑马鱼行为状态，各实验组斑马鱼的死亡数量与毒性情况分析如表2所示，由表2可知各供试品浓度在2000 μg/mL时每组半数以上的斑马鱼出现死亡，各供试品浓度在1000 μg/mL时各组斑马鱼均出现少数死亡，但死亡率明显下降，各供试品浓度在125、250、500 μg/mL时各组斑马鱼均未出现死亡。综上所述，MTC确定为500 μg/mL，且为各供试品的高剂量组；1/9 MTC为56 μg/ml，为低剂量组。

表2 γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽单体的浓度对斑马鱼的影响 Table 2 The effect of γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp and its peptide monomer concentration on zebrafish

2.3 γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽单体对斑马鱼黑白偏好实验的影响

斑马鱼黑白偏好实验（Light-dark test）作为一种焦虑症应激模型，是抗焦虑药物筛选和斑马鱼焦虑模型建立与评价的经典方法，广泛应用于应激反应、精神药理学或神经药理学的基础研究[20,21]。其实验原理是动物具有畏惧白亮区域的特性，其活动会选择在偏黑暗的区域（趋避性），但是面对新奇区域（白亮区域）的刺激又会产生探究的冲动行为，这就造成了探究/趋避的矛盾心理，从而产生焦虑行为。供试品处理14 d后，各组斑马鱼黑白偏好实验结果如图1所示，从图1可以看出各供试品处理后斑马鱼的明区停留时间百分比均高于正常对照组（NC）斑马鱼，EnWH、γ-EWH、γ-EWL、γ-EEWH、γ-EEWL和γ-EEEWH供试品处理组斑马鱼明区停留时间百分比显著（p＜0.05）高于NC组（25.70%），其中γ-EWH（41.66%）和γ-EEWH（39.54%）供试品处理组明区停留时间百分比最高。EnWL、γ-EEEWL、γ-EEEEWH和γ-EEEEWL供试品处理组斑马鱼明区停留时间百分比虽然也高于NC组，但是不具有统计学意义（p＞0.05）。四种肽单体之间相比，γ-EWH和γ-EEWH组斑马鱼明区停留时间百分比显著（p＜0.05）高于EnWL（31.36%）、γ-EEEWL（30.35%）、γ-EEEEWH（32.03%）和γ-EEEEWL（29.07%）组斑马鱼；γ-EWH和γ-EEWH组斑马鱼明区停留时间百分比虽然高于EnWH、γ-EWL、γ-EEWL和γ-EEEWH组斑马鱼，但是差异不显著（p＞0.05）。根据前人研究[21]可知明区停留时间百分比越高说明小鼠探索欲望越强烈，探究/趋避的矛盾行为越少，焦虑症状越低。因此以上结果表明γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽单体均具有降低斑马鱼黑白偏好实验中焦虑样行为的作用，其中二肽和三肽高剂量组的效果最好。

2.4 γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽单体对斑马鱼新鱼缸实验的影响

斑马鱼新鱼缸实验结果如图2所示，结果表明γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽单体处理组斑马鱼在新鱼缸实验中的上下穿梭次数均高于正常对照组（图2柱状图），EnWL、γ-EEEWL、γ-EEEEWH和γ-EEEEWL供试品处理组斑马鱼的在鱼缸中的上下穿梭次数略高于NC组（14.57次），不具有统计学意义（p＞0.05），但是EnWH、γ-EWH、γ-EWL、γ-EEWH、γ-EEWL和γ-EEEWH供试品处理组斑马在鱼缸中上下穿梭次数显著（p＜0.05）高于NC组，其中γ-EWH（25.83）、γ-EWL（22.89）和γ-EEWL（22.40）组斑马鱼在鱼缸中的上下穿梭次数最多。γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽单体处理组斑马鱼在新鱼缸实验中的上半部分停留时间百分比（%）也均高于正常对照组（图2折线图），其中γ-EEEEWH、γ-EEEEWL和NC组之间没有显著差异（p＞0.05），但是其余各供试品处理组均显著高于NC组（22.19%）。γ-EW二肽鱼缸上半部分停留时间百分比最高（高剂量组38.95%和低剂量组36.81%），其次为γ-EEW三肽（高剂量组36.30%和低剂量组34.07%）。Hawkey等[22]研究表明，新鱼缸实验是一种直接、可重复的测量斑马鱼焦虑样行为的方法，当被引入一个新的鱼缸时，斑马鱼通常会潜入鱼缸的底部（趋避性），但是面对新奇区域（鱼缸的上部）的刺激又会产生探究的冲动，常被用来评价斑马鱼的焦虑行为。根据已有研究分析可知γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽单体处理后，斑马鱼趋避行为降低、探索行为增加，焦虑样行为降低。膳食补充γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽单体能够预防和改善新鱼缸实验中斑马鱼焦虑样行为的作用，其中的γ-EW二肽和γ-EEW三肽效果较好。

2.5 γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽单体对斑马鱼大脑TPH酶活性和5-HT水平的影响

大脑组织突触间隙5-HT水平异常是焦虑症产生的主要原因，Trp作为5-HT的主要前体物质，其在大脑组织中的水平及其生物利用度直接影响中枢神经系统5-HT水平[23]。因此研究了γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽单体对斑马鱼体内5-HT水平的影响，γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽单体处理后2周后各组斑马鱼大脑组织匀浆上清液中5-HT水平如图3所示（黑色方格），EnWH、EnWL、γ-EWH、γ-EWL、γ-EEWH、γ-EEWL和γ-EEEWH处理组斑马鱼大脑组织5-HT水平均显著（p＜0.05）高于NC（352.07 ng/mL）组，其中γ-EEEEWH和γ-EEEEWL处理组斑马鱼5-HT水平虽然也高于NC组，但是不具有统计学意义（p＞0.05）。γ-EEEWL处理组斑马鱼大脑组织5-HT水平显著（p＜0.05）低于NC组。目前已知临床上用的抗焦虑症的药物的作用机制大部分是通过增加大脑组织突触间隙5-HT水平进而影响神经信息传递而发挥作用[24]。研究结果与药物改善焦虑症的效果一致，表明膳食补充Trp肽可以增加大脑组织5-HT水平，进而起到预防和改善焦虑症的作用。TPH酶是促进5-HT合成的关键限速酶，其活性和基因表达异常均可导致5-HT合成混乱，进而引发中枢神经系统相关疾病[25,26]。斑马鱼大脑组织中TPH酶活性测定结果如图3所示（红色圆圈），结果表明与NC组（447.03 U/L）相比，各供试品处理组斑马鱼TPH酶活性均显著（p＜0.05）降低。各供试品处理组斑马鱼TPH活性在630 U/L以上的组分按照依次降低的顺序可描述为为：γ-EWH（637.95 U/L）＞γ-EEWH（636.67 U/L）＞γ-EWL（620.41 U/L）＞EnWH（612.50 U/L）。综上所述，γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽单体均能够增加斑马鱼TPH酶活性和提高中枢神经系统5-HT水平，其中γ-EW和γ-EEW的改善效果明显优于γ-EEEW、γ-EEEEW。因此γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽单体可能是改善焦虑症状的潜在膳食补充剂。

2.6 γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽单体对斑马鱼大脑IDO酶活性和KYN水平的影响

IDO酶是KYN合成的关键限速酶、也是Trp向KYN代谢途径转化的关键限速酶，研究表明机体在炎症和感染状态下由肝外组织分泌的IDO酶被激活而发挥作用，进而增加KYN的合成[27]，造成Trp耗竭，降低神经递质5-HT的合成和Trp的生物利用度。斑马鱼大脑组织IDO酶活性和KYN水平测定结果如图4所示，结果表明γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽单体处理后斑马鱼大脑组织IDO酶活性与正常对照组之间没有显著差异（p＞0.05），不具有统计学意义。除了γ-EEEWL组外，其余各供试品处理组斑马鱼大脑组织KYN水平均与正常组之间没有显著差异（p＞0.05）。研究表明KYN可进一步被代谢为具有神经毒性作用的3-羟基犬尿氨酸和喹啉酸，并且KYN及其代谢产物水平异常与焦虑症密切相关[28]。综上所述，研究结果表明γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽单体处理后对斑马鱼大脑组织IDO酶活性和KYN水平的影响均不显著，说明正常机体膳食补充γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽单体后对机体大脑组织中IDO酶活性和KYN水平没有明显的影响。

2.7 γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽单体对斑马鱼大脑Trp代谢途径的影响

中枢神经系统5-HT的水平除了取决于大脑组织Trp的浓度外还取决于Trp的生物利用度，但是Trp的生物利用度受到其代谢途径的影响，根据Trp代谢产物的不同可将其分为Trp-KYN代谢途径和Trp-5-HT代谢途径[29,30]。研究5-HT与Trp的比值（5-HT/Trp）可以间接反应Trp向5-HT代谢途径的转化率，研究KYN与Trp的比值（KYN/Trp）可以间接反应Trp向KYN代谢途径的转化率。由表3可知，与NC组相比，γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽单体处理2周后斑马鱼大脑组织Trp浓度均有所增加，其中EnW、γ-EW和γ-EEW高低剂量组、γ-EEEWH和γ-EEEEWL处理组显著增加（p＜0.05），但是γ-EEEWL和γ-EEEEWH处理组斑马鱼大脑组织Trp浓度也高于NC组，但是差异不显著（p＞0.05）。EnWH、γ-EWH、γ-EWL、γ-EEWH供试品处理组5-HT/Trp值显著（p＜0.05）高于NC组（1586.98）斑马鱼，其中γ-EWH（1734.37）和γ-EEWH（1722.13）组的5-HT/Trp值最高，显著（p＜0.05）高于其余各组，说明γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽单体能够上调Trp-5-HT代谢途径。γ-EEEWL和γ-EEEEWH处理组除外，与NC组相比，各供试品处理组斑马鱼大脑组织KYN/Trp值均显著（p＞0.05）降低，其中γ-EWH（1205.85）和γ-EEWH（1202.27）组的KYN/Trp值最低，说明γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽单体能够下调Trp-KYN代谢途径。综上所述，γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽单体供试品处理后，斑马鱼的大脑组织Trp浓度和5-HT/Trp值增加，KYN/Trp值降低，说明γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽单体膳食补充后改善斑马鱼焦虑样行为可能是通过提高Trp浓度和上调Trp-5-HT代谢途径，进而增加Trp的生物利用度而发挥作用。

表3 γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽单体对斑马鱼Trp代谢途径的影响 Table 3 The effect of γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp and its peptide monomer on Trp metabolism of zebrafish

3 结论

本研究以γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp、γ-Glu-Trp、γ-[Glu]2-Trp、γ-[Glu]3-Trp和γ-[Glu]4-Trp（肽单体）作为膳食补充剂，研究γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽单体对斑马鱼焦虑样行为的改善作用。结果表明，与正常对照组相比，膳食补充γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽单体后，斑马鱼新鱼缸实验和黑白偏好实验中的焦虑样行为均出现不同程度的下降，其中γ-Glu-Trp和γ-[Glu]2-Trp处理组焦虑样行为降低的最为显著（p＜0.05）。生化指标测定结果表明γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp、γ-Glu-Trp、γ-[Glu]2-Trp、γ-[Glu]3-Trp和γ-[Glu]4-Trp供试品处理后斑马鱼大脑组织Trp浓度、TPH酶活性和5-HT水平均显示不同程度的增加。此外，γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽单体可诱导Trp-5-HT代谢途径上调。分析其作用机制可能是γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽单体膳食补充后作为Trp的直接来源增加了机体Trp的浓度，又通过增加TPH酶活性诱导Trp-5-HT代谢途径上调，增加Trp的生物利用度，提高大脑组织5-HT水平。综上所述，与正常对照组斑马鱼相比，γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp及其肽单体处理的斑马鱼具有抗焦虑、增加大脑组织Trp浓度、TPH酶活性和5-HT水平，上调Trp-5-HT代谢途径的作用，从而证明膳食补充γ-[Glu](1≤n≤4)-Trp、γ-Glu-Trp、γ-[Glu]2-Trp、γ-[Glu]3-Trp和γ-[Glu]4-Trp具有预防和改善焦虑症的作用，其中γ-Glu-Trp和γ-[Glu]2-Trp的作用最为显著。