人TRAM基因真核表达载体的构建

2022-06-29高建伟叶峰蒋宏峰

北京生物医学工程 2022年3期

高建伟叶峰蒋宏峰

0 引言

TRAM(TRIF-related adaptor molecular)是Toll样受体4(Toll like receptor 4,TLR4)信号通路中的一种接头蛋白，参与了机体固有免疫应答产生干扰素(interferon，IFN)的信号通路[1]。TRAM蛋白含有235个氨基酸，C端含有Toll/IL-1 receptor(TIR)结构域可与TRIF蛋白作用，通过激活下游的转录因子IRF3诱导产生干扰素[2]。干扰素具有抗病毒活性，可通过激活信号级联反应，在病毒进入、转录、RNA稳定性、翻译、成熟和释放等多阶段干扰病毒在机体内增殖[3]，在抗病毒方面发挥重要作用。TRAM作为一个TLR4信号通路的调节点，引导信号通路朝向产生干扰素的方向，然而TRAM蛋白是通过什么机制引导TLR4信号的尚不完全清楚。因此，本文拟构建TRAM的真核细胞表达质粒，通过转染入细胞以诱导或增强TLR4信号通路，为进一步研究TRAM的功能及在产生干扰素信号通路中的作用提供研究工具。

1 材料和方法

1.1 材料

人急性单核细胞性白血病细胞(THP-1)购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，HEK-293T细胞购自美国菌种保藏中心(ATCC)，Trizol试剂、Lipofectamine 3000转染试剂购自美国Invitrogen公司，M-MLV反转录酶购自Promega公司，KOD-Plus-Ver.2和KOD Dash购自TOYOBO公司，pCMV-N-Flag质粒购自碧云天公司，限制性内切酶SmaⅠ、EcoRⅠ和T4 DNA连接酶购自TAKARA公司，通用型DNA纯化回收试剂盒、凝胶回收试剂盒和DH5α感受态细胞购自康为世纪公司。

1.2 方法

1.2.1 TRAM蛋白编码序列的扩增

用Trizol试剂提取THP-1细胞总RNA，以RT-PCR的方法将RNA反转录为cDNA。再以cDNA为模板，采用PCR的方法扩增TRAM编码区的序列，上游引物：5′ tcccccggggggtatcgggaagtcta 3′，下游引物：5′ ccggaattctcaggcaataaattgt 3′。上下游引物分别引入SmaⅠ和EcoRⅠ酶切位点，采KOD-Plus-Ver.2高保真酶进行PCR。PCR 产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，切取含目的序列的凝胶，使用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行回收。

1.2.2 pCMV-N-Flag-TRAM重组载体的构建

应用限制性内切酶SmaⅠ和EcoRⅠ，对纯化的PCR产物和pCMV-N-Flag质粒分别进行双酶切，37 ℃，反应2 h。通过T4 DNA连接酶将酶切后的DNA片段和pCMV-N-Flag质粒进行连接反应，16℃过夜。将连接产物转化DH5α感受态细胞，接种到含卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养过夜。

1.2.3 重组载体的筛选鉴定

随机挑取LB固体培养基上的克隆进行菌落PCR，将菌落PCR结果为阳性的克隆接种到含卡那霉素的LB液体培养基中，置于37℃摇床内，150 r/min培养过夜，将培养的菌液送公司测序。测序结果与NCBI blast进行比对，与TRAM序列一致的重组载体命名为pCMV-N-Flag-TRAM。

1.2.4 重组载体的表达验证

采用Lipofectamine3000，将重组载体pCMV-N-Flag-TRAM转染HEK-293T细胞。待细胞融合约70%时进行操作，以转染空载体pCMV-N-Flag的HEK-293T细胞作为对照，培养48 h后，提取蛋白进行SDS-PAGE电泳后，通过湿法将蛋白转至硝酸纤维素膜。抗体采用Anti-Flag单克隆抗体(1∶500)和GAPDH单克隆抗体(1∶1000)，4 ℃孵育过夜。二抗采用荧光标记的羊抗小鼠IgG(1∶12000)，室温孵育2 h。使用Odyssey Sa近红外激光成像系统对膜上的荧光信号进行检测。

2 结果

2.1 TRAM序列的扩增

提取细胞总RNA，经反转录获得cDNA，以cDNA为模板经PCR扩增得到的产物，加样到1%琼脂糖凝胶进行电泳，可见在800 bp附近有一条很亮的条带，且未见杂带，与预期的TRAM编码区目的片段大小位置一致，如图1所示。

1—DMarker Ⅲ；2,5—PCR阳性产物图1 TRAM编码区PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果Figure 1 The agarose gel electrophoresis results ofPCR product from TRAM coding sequence

2.2 重组质粒的筛选鉴定

扩增片段与质粒连接后的产物转化大肠杆菌后，挑取LB固体培养基上的克隆进行菌落PCR，琼脂糖凝胶电泳结果(图2)显示，泳道2和3在800 bp附近出现了目的条带，初步表明泳道2和3对应的菌落含有阳性的重组载体。取阳性菌落培养过夜，提取质粒，经生工公司测序显示如图3，此序列经与NCBI/BLAST RefSeq RNA数据库比对，构建的序列与TRAM序列100%一致。

图3 测序片段峰图Figure 3 The sequencing segment peak figure

2.3 Western blot检测Flag-TRAM蛋白在HEK-293T细胞的表达

实验设立3组，分别是：未转染质粒组，作为空白对照；转染pCMV-N-Flag质粒为空质粒组，作为载体对照；转染pCMV-N-Flag-TRAM重组质粒组。Western blot结果显示，转染重组质粒组在约37kD处出现了特异性蛋白条带，空白对照组和载体对照组均未出现目的条带(图4)。

1—预染蛋白Marker；2—未转染组；3—空转染组；4，5—转染重组质粒组图4 Flag-TRAM重组蛋白的表达Figure 4 The expression of Flag-TRAM recombinant protein

3 讨论

干扰素是一种广谱抗病毒效应分子，通过多个靶点有效干扰病毒的复制。机体产生适量的干扰素，在对抗病毒感染性疾病中起着非常重要的作用[4]。病毒感染时释放的RNA和蛋白等病毒组分可激活TLR4介导的固有免疫应答反应，TLR4的信号可通过两组接头蛋白TRAM-TRIF和TIRAP-MyD88形成两条不同的信号通路进行转导，分别激活IRF3转录因子诱导IFN-β、激活NF-κB转录因子诱导炎症因子的产生[5]，TLR4对接头蛋白的选择性决定了不同的转录因子激活途径。然而，这两个通路的不平衡可导致多种疾病，如果干扰素产生不足，病毒不能有效清除可导致病毒感染持续加重，而如果炎症因子产生过多，导致出现炎症因子风暴，对机体多脏器产生损伤[6]。因此，深入研究TRAM参与TLR4信号通路的机制，将有助于针对TRAM进行调控，引导TLR4介导的信号通路向产生干扰素的途径，这是抗病毒治疗的一个策略。

本研究采用pCMV-N-Flag质粒作为构建重组载体的骨架，将TRAM mRNA的CDS编码区构建到多克隆位点。实验中将PCR得到的TRAM的编码区通过多克隆位点插入到载体序列，应用菌落PCR的方法，鉴定插入目的片段的阳性克隆。由于PCR过程中可能会出现碱基错配、碱基缺失或碱基增加的情况，为了进一步确认插入片段的碱基序列与目的TRAM序列完全一致，因此应用DNA测序的方法，筛选序列完全一致的克隆。将菌落进行大量培养，提取重组质粒载体，通过Lipofectamine 3000转染的方法，将构建的重组载体pCMV-N-Flag-TRAM转染HEK-293T细胞中，使TRAM蛋白在细胞中高表达，应用Western blot检测到在37kD位置有Flag抗体的条带，可见是Flag的融合蛋白，而未转染质粒组和转染pCMV-N-Flag空质粒组在37kD处均未出现条带。