放散式冲击波治疗双侧卵巢切除大鼠晚期骨质疏松症的实验研究

2022-06-29杰永生郭安忆綦惠郑蕊梁震景金珠刘亚军

北京生物医学工程 2022年3期

杰永生郭安忆綦惠郑蕊梁震景金珠刘亚军

0 引言

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种以骨量减少、骨组织微结构退变为特征的疾病，临床上表现为骨密度(bone mineral density，BMD)降低，骨脆性增加，骨折风险增加。OP发病的根本原因在于骨吸收与骨形成之间的平衡被打破。骨吸收加速或骨形成不足，均会引起OP[1-3]。目前OP的防治手段多以抑制骨吸收的药物为主，虽然抑制了骨吸收过程，但难以恢复已丢失的骨量，且存在诸多不良反应[1-3]。因此，如何促进骨形成或改善骨吸收/形成的平衡是近年来研究的热点，对预防和治疗OP具有重要意义。

体外冲击波根据其产生的压力波形，分为聚焦式和放散式两种。作为一种非手术性、微创、价格低廉的治疗方式，体外冲击波在骨科领域显示出巨大的应用前景[4-6]。既往的研究表明，聚焦式冲击波能够激活干细胞成骨转化功能，并促进新生血管形成和骨钙沉积[7]。但是放散式冲击波在骨再生中的作用，当前的研究仍较为粗浅。

既往的临床研究证实，放散式冲击波对骨不连患者有良好的促进骨组织再生的作用。但是放散式冲击波对OP骨生成的促进作用未有确切证据。本实验以双侧卵巢切除的大鼠为研究对象，分析放散式冲击波对于股骨颈局部骨生成的作用，为放散式冲击波在OP领域的临床应用奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要仪器

实验动物：清洁级SD雌性大鼠购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，12周龄(200～250 g)。

主要仪器：台式高速离心机(Eppendorf 德国)，生物力学机(Mini Bionix，德国)，数显游标卡尺(宝航，苏州)，酶标仪(Biorad，美国)，Micro-CT机(Skyscan，瑞士)，放散式冲击波仪(STORZ，瑞士)。

1.2 实验方法

SD雌性大鼠18只，随机分为Sham组、OP组及OP+冲击波治疗组，每组6只。

OP模型的建立与冲击波治疗：大鼠适应性饲养1周。OP组和OP+冲击波治疗组，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(0.0019 mL/100g)，手术区备皮，碘伏消毒，在髂嵴上约 2 cm、脊柱旁约 1 cm 处做横切口，逐层切开，进入腹腔，在白色脂肪中可见卵巢，双侧输卵管结扎后，进行双侧卵巢切除，逐层缝合伤口。Sham组麻醉和暴露卵巢方法不变，但不进行卵巢切除。术后6个月，OP+冲击波治疗组，将大鼠在麻醉状态下对左侧股骨颈进行放散式冲击波治疗，皮肤涂抹耦合剂，将冲击波探头至于股骨颈的位置，参数设置：2 bar(1 bar=105Pa)，4 Hz，2 000次冲击。每周治疗1次，共治疗3次。

HE染色：取下大鼠股骨，多聚甲醛固定，EDTA脱钙。脱水、石蜡包埋，烤片过夜后，常规HE染色。

抗酒石酸碱性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)染色：切片制备方法同HE染色。按照TRAP染色试剂盒的方法进行试剂的配置，去离子水置于 37 ℃水浴中备用。切片在PBS中洗涤1次，加入适量固定剂室温放置1 min，倒掉固定剂，加入适量去离子水，清洗2次。加入反应液37 ℃避光孵育 1 h，弃去，去离子水清洗3次后，苏木素溶液复染。

micro-CT分析：取下大鼠股骨，多聚甲醛固定，进行全股骨扫描，图像分析软件对扫描后的图像进行三维重建并分析，分析获得的指标包括：骨密度(BMD)，骨体积分数(BV/TV)，骨小梁数量(Tb.N)，骨小梁厚度(Tb.Th)，骨小梁分离度(Tb.Sp)。

力学检测(椎体压缩实验)：取下大鼠腰椎第3、4节段，剔除肌肉、韧带等，生理盐水浸湿纱布后包裹，至于-20 ℃冰箱保存。实验时将椎体节段至于生物力学机的样本平台上，调节横梁位置使上压头刚好与椎体接触。每100 ms采集一组数据，压缩速度为1.8 mm/min，载荷最大值 1999 N，当压头与椎体接触，并产生压缩性骨裂时，实验终止。记录终止时的用力(N)。

血清学分析：心脏取血5 mL，颠倒混匀后至于室温2 h，2000 r/min离心10 min，分装后置于-80 ℃冰箱保存。根据骨钙素(osteocalcin，OCN)和Ⅰ型胶原C端肽(C-terminal telopeptide of type I collagen，CTX-I)ELISA试剂盒的说明书进行实验。OCN的检测：样本室温下解冻，于6000～10000 r/min离心30 s。用1 mL样本稀释液进行标品的溶解，吹打5次助溶，充分混匀得到标准品S7，浓度为20 pg/mL。倍比稀释，得到S6、S5、S4、S3、S2、S1，浓度分别为10、5 、2.5、1.25、0.625、0.312 pg/mL。加样，每孔100 μL，37 ℃孵育2 h。依次进行生物素标记的抗体、辣根过氧化物酶标记的抗体以及底物工作液等的孵育。最后在酶标仪上进行OD450的检测。CTX的检测：样本室温下解冻后离心和稀释。以1∶10的比例稀释酶混合物溶液，酶标板上加入标准品(S0～S5)以及待测样品，并依次加入稀释后的酶混合物溶液，37 ℃孵育1 h。加入显色剂A和显色剂B，避光显色后，加入stop工作液，酶标仪上进行OD450的检测。

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示。多组均数组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 组织学切片观察

股骨近端脱钙切片HE染色，观察骨小梁结构显示，Sham组的骨小梁呈纵向排列交织成网状的结构，骨小梁较粗，数量多；与Sham组相比，OP组骨小梁变细，稀疏，数量减少；OP+冲击波治疗组的骨小梁数量和粗细与OP组相比并无太大改善，仍较稀疏(图1)。TRAP染色阳性的为破骨细胞，破骨细胞数在各组分别为：Sham组29.5±5.3，OP组71.8±10.1，OP+冲击波治疗组63.8±12.1，且OP组和OP+冲击波治疗组的破骨细胞数与Sham组相比均显著升高(P<0.05)。

图1 股骨近端HE染色(左)和TRAP染色(右)Figure 1 Representative HE staining(left) and TRAPstaining(right) images of the proximal femur in rats

2.2 Micro-CT结果分析

取各组大鼠的股骨标本并对股骨近端进行micro-CT扫描与重建。结果显示Sham组骨小梁连续，结构正常，较粗，厚度均匀。OP组骨小梁不连续，结构较为混乱，较细。OP+冲击波治疗组，与OP组对照观察发现，虽然骨小梁结构也呈断续状，但小梁整体宽度有所增加(图2)。但是定量检测，表示骨体积分数的BV/TV在各组间并无明显差别，Tb. Th、Tb. N、Tb. Sp在各组间也未有明显差别。骨密度统计结果表明，OP组和OP+冲击波治疗组的BMD与Sham组相比，均有显著下降(P<0.05)，但治疗前后BMD未有显著差异(表1)。

图2 股骨近端micro-CT观察Figure 2 Representative micro-CT and 3D imagesof the proximal femur in rats

表1 Micro-CT结果的定量分析Table 1 Quantitative analysis of the results of

①与Sham组相比P< 0.05

2.3 血清学检测结果分析

血清OCN与CTX-Ⅰ分别反映成骨细胞与破骨细胞的活性，是临床常用来分析患者OP与否的两个血清学指标。检测结果表明，尽管应用了放散式冲击波对晚期OP进行治疗，但血清学OCN与CTX-Ⅰ在各组之间并未发现显著差异(表2)。

表2 各组大鼠血清中OCN和CTX-Ⅰ的比较Table 2 Concentrations of OCN and CTX-Ⅰ in the

2.4 椎体压缩实验结果分析

腰椎椎体压缩性骨折也是OP的常见并发症之一。由于放散式冲击波的能量会传递到其他部位，由此推测，如果椎体能够接受到冲击波作用，有可能也会有相应变化。因此，对L3和L4的抗压缩性能进行检测。结果表明，与Sham组相比，OP组和OP+冲击波治疗组的压缩受力显著下降(P<0.05)，但冲击波治疗并未改善这种下降(图3)。

图3 椎体压缩实验结果(n=6)Figure 3 The duration strength of vertebral compression in L3 and L4 of rats (n=6)

3 讨论

随着社会老龄化进程加快，OP发病率越来越高，相关并发症给个人和社会带来沉重负担，OP已成为全球性的公共健康问题。

本研究以双侧卵巢切除的老年大鼠为研究对象，双侧卵巢切除的大鼠由于其激素水平的变化，较好地模拟了人类OP的发生发展。卵巢切除后，给予股骨颈放散式冲击波治疗。HE染色和micro-CT扫描结果表明，与sham组相比，OP组骨小梁稀疏，数量变少，BMD显著降低，证实OP模型建立成功。但是，冲击波治疗后，均未显示出骨小梁结构和密度的明显改变。TRAP为破骨细胞所特有特异性标记酶，其活性的变化可以作为判断骨组织代谢的特异性指标[8-12]，TRAP染色结果显示，破骨细胞计数在冲击波治疗组与OP组之间也未有显著差异，因此冲击波治疗并未对OP状态下骨吸收增强的情况有所改变。同时，椎体压缩实验在OP与治疗组之间也未有明显差别。这些结果均提示，放散式冲击波治疗对于股骨颈以及椎体结构的改变均无明显作用。

分析原因，一方面放散式冲击波的设置包含能量、频率和次数3个参数，不同参数设置会有不同的效果，实验中仅采用了一组参数设置，该参数是临床治疗骨折不愈合的经验设置，尽管采用该参数设置进行治疗的骨折不愈合患者再次愈合的概率很高，但是对于OP这种不完全相同的病理状态，该参数设置不一定同样有效，后续将进一步补充相关组别，观察不同参数设置对OP治疗的差异。第二方面，大鼠是在OP术后6个月开始进行治疗时，已形成较为严重的OP，单纯的冲击波疗法有可能改变或逆转严重OP的效果十分有限。如需较好效果，可能需要结合其他治疗方法。第三方面，OCN与CTX-Ⅰ分别反映成骨细胞与破骨细胞的活性，二者在血清中的水平是临床常用来分析患者OP与否的血清学指标，能够快速反映骨代谢的变化，其敏感性远远高于BMD的变化[8-12]。实验表明，血清OCN和CTX-Ⅰ的水平在冲击波治疗组与OP组之间亦没有显著差异。结果进一步证实，机体整体状态未有明显改善。