甜菊糖苷单体制备研究进展

赵聪敏，呼念念，江利华

（河北工程大学生命科学与食品工程学院邯郸市天然产物与功能食品开发重点实验室，河北 邯郸 056107）

甜菊糖是从甜叶菊中提取分离得到的一种天然、保健的新型甜味剂，具有热量低、甜度高等特点，甜度是蔗糖的250倍～300倍，无毒，无副作用[1]，具有抗氧化、抗肿瘤、抗癌、抗炎，预防龋齿、肥胖症、糖尿病，降压、降血脂及降血糖等作用，发展前景广阔[2-10]。甜菊糖含有糖苷类、生物碱、黄酮类等营养成分，甜菊糖苷占绝大部分，甜菊糖苷由多种单体化合物组成，每种单体各具特色。例如莱鲍迪苷A（rebaudioside A，RA）、莱鲍迪苷D（rebaudioside D，RD）和莱鲍迪苷M（rebaudioside M，RM）等单体甜度高、口感较佳，可将其单独添加到糕点、糖果、饮料中，直接作为一种甜味剂使用[11-14]；甜菊双糖苷具有降血糖、抗结核等生理功能，可应用于医药领域；莱鲍迪苷 A、甜菊双糖苷（steviolbioside，SX）作为中间体衍生化成某种生理活性更突出的化合物[15]。但是甜菊糖苷只有莱鲍迪苷A和甜菊苷（stevioside，STV）单体含量较高，其他单体含量极低；而且单体之间性质差异不显著使得甜菊糖苷单体分离制备存在一定困难[16]。本文综述了甜菊糖苷单体制备的方法，以期优化制备高纯度低成本甜菊糖苷产品的工艺路线，为实现甜菊糖苷各单体工业化生产提供参考依据。

1 甜菊糖结构与性质

甜菊糖是从甜叶菊中提取分离得到一类糖苷物质，甜菊糖苷占甜菊糖的80%以上，目前常见有13种糖苷，具体的结构、性质见图1和表1[17]。

图1 甜菊糖苷结构通式Fig.1 General structure of stevia glycoside

表1 13种糖苷的化合物名称、R1位取代基和R2位取代基Table 1 Compound names,R1and R2substituents of 13 stevia glycosides

2 甜菊糖苷单体的制备方法

2.1 提取法

2.1.1 树脂法与重结晶法

树脂法与重结晶法是单体制备备受青睐的途径，工业生产上普遍使用树脂法结合重结晶法来分离制备莱鲍迪苷A[18]，采用树脂法与重结晶法制备其他甜菊糖苷单体也有报道。

一般采用 D107、D108、LX-T28、LX-T81 等传统大孔吸附树脂结合重结晶法制备高纯度莱鲍迪苷A和甜菊苷。但因甜菊糖苷各单体结构较为接近，上述这些树脂在制备甜菊糖苷单体时吸附容量与选择性不能同时兼备，只能分离制备含量较多的组分，很难得到其他单体。慕峰等[19]研发了一种高交联、带有大量弱极性酯基的新型大孔吸附树脂，以甜菊糖粗提物为原料，在上样量14 BV，以30%乙醇作为洗脱剂的工艺条件下制备得到了纯度大于20%、得率大于70%的莱鲍迪苷D，实现了莱鲍迪苷D的部分富集，克服了传统树脂不能兼备良好的吸附性和选择性的缺陷；但得到的单体纯度低，需要进一步提高提纯能力。文献[20]提到以甜菊糖结晶母液干粉为原料，通过多次重结晶去掉甜菊糖结晶母液中的莱鲍迪苷A，然后以MN-100大孔吸附树脂，乙醇水作为洗脱剂，通过乙醇水重结晶，使莱鲍迪苷D单体纯度、产率分别达95%、70%以上，实现了莱鲍迪苷D的高富集。

利用树脂法与重结晶法可以大量制备甜菊糖含量较多的单体莱鲍迪苷A、甜菊苷，提纯能力较强，易于工业化生产；但对于含量较少的单体来说，操作工艺复杂、生产成本较高、制备分离难度大、分离效果较差，甜菊糖苷单体纯度达到98%以上比较困难。

2.1.2 色谱法

色谱法又称柱层析法，主要有吸附柱层析、凝胶柱层析、制备层析等方法，其中制备层析法即制备型色谱法是目前甜菊糖单体制备常用的色谱法，该法是基于分析性高效液相的原理，利用流动相中的各组分与固定相发生相互作用力的差异，达到分离纯化的目的[21]。

张立鹏等[22]以C18作为色谱柱填料，分别以70%甲醇水和90%甲醇水作流动相，经过高压制备型液相色谱两次分离纯化，得到莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C（rebaudioside C，RC）、甜菊苷及甜菊双糖苷单体，这5种单体纯度均大于90%；然后通过甲醇重结晶，使这5种单体纯度均大于98%。

张凌云等[23]采用中压制备色谱仪，以改性羧基填料填充色谱柱，80%乙腈水作为流动相，进样浓度为280 mg/mL，进样体积为0.4 mL，流速为4 mL/min，在此条件下分离甜菊糖结晶母液莱鲍迪苷A，最终得到纯度为90.22%、得率为79%莱鲍迪苷A。

色谱法可制备毫克级别甚至克级别的高纯度甜菊糖苷单体，但流程繁琐、溶剂消耗量大、价格优势差、产量远远不能满足市场需求；而且让较难分离的甜菊糖苷单体纯度达到95%以上，需要与其他方法相结合使用。

2.2 化学合成法

化学合成法是以简单、易得的物质作为起始原料，通过水解反应、取代反应、置换反应、沉淀反应等有机化学反应，生成其他复杂物质的过程。

Wen等[24-25]以甜菊糖苷为起始原料，研究莱鲍迪苷R（rebaudioside R，RR）和莱鲍迪苷S（rebaudioside S，RS）的化学合成，采用了线性和汇聚式方式完成了莱鲍迪苷R的合成，采用模块化合成策略成功制得高含量莱鲍迪苷S。

文献[26]指出，以莱鲍迪苷C作为底物，莱鲍迪苷C与R3化合物（见图2）在碳酸银的作用下，于30℃～100℃下发生取代反应，该反应持续12 h～24 h，得到合成莱鲍迪苷M的中间体；随后莱鲍迪苷M的中间体在碳酸钾的作用下发生水解反应，然后调整溶液pH值，再经乙醇水重结晶，实现了莱鲍迪苷C高效合成莱鲍迪苷M。

图2 R3化合物Fig.2 R3compounds

因原料廉价易得、反应条件温和、操作工艺简便、生产方便快速、投资少，化学合成法成为甜菊糖苷单体制备的重要的手段之一。但是利用化学法合成甜菊糖苷的研究较少，该法对合成甜菊糖的研究停留在试验阶段，相关策略体系不完备不成熟。

2.3 生物合成与转化法

2.3.1 生物合成

甜菊糖的生物合成一般是指植物体内最初的物质，通过甲基赤藓糖醇途径逐步合成异戊烯焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP），在一系列酶的作用下转化成甜菊醇；之后甜菊醇在各类UDP-糖基转移酶（UDP-glucosyltransferase，UGTs）作用下合成其他衍生物[27]。

文献[28]指出通过甲基赤藓糖酵途径，丙酮酸和甘油醛-3-磷酸在各种酶的作用下，一步步催化缩合成牻牛儿牻牛儿焦磷酸（geranium geranium pyrophosphate，GGPP）；然后在 SrCPPS、SrKS、SrKO 和 SrKAH等几种酶基因作用下，牻牛儿牻牛儿焦磷酸转化为甜菊醇；随后甜菊醇在UDP-葡糖基转移酶（UDP-glucosyltransferase，UGTs） 基因 SrUGT85C2、SrUGT74G1 和SrUGT76G1的作用下经过一系列糖基化形成甜菊苷和莱鲍迪苷A。

在甜菊糖苷生物合成途径中以UDP-葡糖基转移酶催化的糖基化反应过程中所需的糖基供体尿苷二磷酸葡萄糖（uridine diphosphate glucose，UDPG）价格高昂，成本高，工业化可行性低，需要完善UDPG的供给策略或者找寻UDP-葡糖基转移酶的替代品。由于拟南芥蔗糖合成酶SUS1可以构建糖基供体尿苷二磷酸葡萄糖再生循环利用体系，唐小雁等[29]在探索以甜菊苷作为底物合成莱鲍迪苷A的过程中，通过将UDP-糖基转移酶与蔗糖合成酶两步催化反应结合起来，构建重组酵母工程菌GS115/pPIC9K-UGT/pPICZA-At－SUS，经诱导表达获得重组酶，形成双酶共表达体系；在此基础上对催化反应条件进行了优化，得到了较佳反应条件，实现了更高效催化甜菊苷合成莱鲍迪苷A，使工业化生产成为可能。王婉洁等[30]在探索以莱鲍迪苷A作为底物合成莱鲍迪苷D的过程中，考虑用其他类型的酶取代UDP-葡糖基转移酶，探索了葡萄糖糖基转移酶和交替糖蔗糖酶的催化效果，研究结果发现来源于嗜柠檬酸明串珠菌L.citreum CICC23234的交替糖蔗糖酶可以将莱鲍迪苷A更有效地催化合成莱鲍迪苷D的同分异构体，并经过甜味特性研究发现，该法得到的莱鲍迪苷D的同分异构体，溶解度较高，味感较好。

采用生物合成还实现了莱鲍迪苷E（rebaudioside E，RE）催化合成莱鲍迪苷D[31]，甜菊苷E催化合成莱鲍迪苷M[32]。

2.3.2 生物转化

甜菊糖苷的生物转化一般是指利用生物或酶将单糖或寡糖长链引入到甜菊糖苷配基的C13和C19位活泼氢或者糖基部位的羟基上形成新的化合物[27]。

杨凤平[33]在腐生葡萄球菌（Staphylococcus saparophyticus）、梧青霉（Penicillium citrinum）、木霉（Trichoderma spp）、粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）、嗜松青霉（Penicillium pinophilum CGMCC NO.6366）、冠突散囊菌（Eurotium cristatum）这6种菌株中筛选发现嗜松青霉可以将甜菊糖苷含有的甜菊苷转化成甜茶苷（rubusoside，RUB）、莱鲍迪苷C转化成杜克苷A（dulcoside A，DA），不会转化莱鲍迪苷A；同时探索以嗜松青霉对转化甜菊糖苷效果的影响因素时，发现在甜菊糖苷底物浓度为2%、pH5、温度为55℃，使用固体培养基培养嗜松青霉孢子阶段产生的酶转化作用较强、效率较高，此时甜菊苷转化率为91.8%、甜茶苷产率为73.23%，莱鲍迪苷C转化率为55.63%，杜克苷A产率为34.57%。然后以乙醇水作洗脱剂，分别使用聚酰胺与AB-8大孔树脂对转化产物进行分离纯化，甜茶苷纯度为91.30%、杜克苷A纯度为83.15%。

文献[34]指出利用大肠杆菌 K-12（E.coli K-12）转基因菌株产生的两种UDP-葡糖基转移酶和一种蔗糖合成酶，将甜菊苷或者莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷AM（rebaudioside AM，RAM），并经过欧洲食品安全管理局（European Food Safety Authority，EFSA）对其进行安全性评价后，允许莱鲍迪苷AM正式作为一种甜味剂使用。

采用生物转化法还成功实现了从莱鲍迪苷E转化成莱鲍迪苷M[35]。并且从莱鲍迪苷A到莱鲍迪苷D的生物转化反应中分离得到莱鲍迪苷D的同分异构体莱鲍迪苷D2[36]和莱鲍迪苷M的同分异构体莱鲍迪苷M2两个次要产物[37]。

因高效可控、选择性高、安全方便等优势，生物合成与转化成为成为甜菊糖苷单体制备常规的途径之一。但生物合成和转化法通常使用的酶成本高，制备的单体纯度较低、缺乏市场竞争力，导致该法在甜菊糖单体制备的应用受到了极大的限制。

3 结论

对于甜菊糖苷单体中莱鲍迪苷A和甜菊苷单体制备研究颇多，工业化生产相对成熟；其他甜菊糖苷单体制备研究较少，仅限于实验室研究或者工业化生产处于起步阶段。目前从整体来看甜菊糖苷单体制备体系方法尚未成熟，工业化生产可行性低，缺少一定的实际应用价值。因此在研究生产过程中如何革新传统生产方式，打破技术壁垒，形成完备的体系方法，来实现甜菊糖苷单体高效分离与高效制备以满足工业化生产的需要是目前研究的热点，也是需要重点攻克的难点之一。