滇橄榄水提物对洛哌丁胺诱导便秘小鼠症状的改善作用

李思锦，高晓余，2*，李桂兰，罗开莲，白忠彬，胡一凡，盛军，田洋，2，.*

（1．云南农业大学食品科学技术学院，云南 昆明 650201；2.食药同源资源开发与利用教育部工程研究中心，云南 昆明 650201；3．云南省生物大数据重点实验室，云南 昆明 650201；4．云南省高原特色农业产业研究院，云南 昆明 650201）

生活节奏快、工作压力大、饮食不规律和熬夜等多种因素使得便秘患病率有所增加，且患病人群有年轻化趋势[1]。目前，治疗便秘主要依靠西药和中成药。西药主要为膨胀性泻剂、刺激性泻剂、渗透性泻剂和促动力剂[2]。长期使用药物会引发多种副作用并对药物产生依赖性[3]，副作用包括腹胀、痉挛、恶心、头痛和呕吐等[4]，而使用天然植物膳食制剂可有效避免这些问题[1]。肠道敏感性降低、滥用泻药是便秘的主要原因[5]，研究表明低纤维饮食会诱导便秘，高纤维饮食可促进粪便排泄，缩短结肠传输时间[6]。富含可溶性膳食纤维的食物被证明对改善便秘有益[7]。不仅大分子物质具有通便作用，中草药中的一些小分子化合物也具有通便作用，如甾体皂甙[8]、槲皮素[9]和柚皮素[10]等。饮食疗法往往比药物疗法有更好的依从性，这有助于更好地治疗便秘[4]。《中国药典》记载，余甘子可用于防治消化不良、血热血瘀、腹胀、咳嗽等。余甘子富含酚类、维生素、氨基酸、黄酮等生物活性物质，具有很好的抗氧化、抗肿瘤、降血糖、护肝等活性和药理作用，同时还具有突出的抗炎功效[11]。滇橄榄（又名云南余甘子）在润肠通便方面可能具有良好的作用效果，但这一方向的研究较少。滇橄榄具有很好的加工性能，在药品和保健食品开发方面具有较大的潜力[12]。本研究以滇橄榄为原料，制备其水提物，采用洛哌丁胺诱导便秘小鼠模型，从粪便性状和肠道蠕动两个方面明确滇橄榄的润肠通便作用，以期为开发以滇橄榄为原料的通便功能食品奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

滇橄榄（P.emblica）：云南省普洱市宁洱县。

昆明种小鼠（无特定病原体动物）：72只，17g～20g，成都达硕动物实验有限公司，饲喂在云南农业大学食药同源资源开发与利用教育部工程研究中心动物实验室。

麻仁丸：北京同仁堂股份有限公司；洛哌丁胺：默克生命科学（上海）有限公司；阿拉伯树胶、活性炭粉：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

20目标准检验筛：浙江上虞市华丰五金仪器有限公司；BSA124S-CW电子天平：北京赛多利斯天平有限公司；HH-6数显恒温水浴锅：常州华普达教学仪器有限公司；FD-1A-50真空冷冻干燥机：上海比朗仪器制造有限公司；TGL20M大型高速离心机：湖南湘立科学仪器有限公司；DZF-6020真空干燥箱：予华仪器有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 滇橄榄水提物制备

滇橄榄的食用方式主要为口含、泡服或咀嚼，因此本实验以滇橄榄水提物为原料进行功效评价。选择新鲜、色泽淡黄、成熟度适宜、无霉变腐烂的滇橄榄，用流动水充分洗净后去核，切成小块备用。精密称量100 g滇橄榄果实小块，以料液比1∶10（g/mL）加入到1 000 mL超纯水中，混匀后沸水煮3min，立即过滤。将滤渣继续以料液比1∶10（g/mL）加入到1 000 mL超纯水中，沸煮1 min，立即过滤，继续重复此操作1次。将3次的滤液混合后于大型高速离心机离心（4 000 r/min，10 min），取上清液真空冷冻干燥，得滇橄榄水提物。

1.3.2 洛哌丁胺的配制

精确称量400 mg洛哌丁胺，溶于50 mL 0.9%生理盐水中，使其终浓度为8 mg/mL，备用。

1.3.3 麻仁丸混悬液的配制

将麻仁丸（6 g/丸）溶解在0.9%生理盐水中至终浓度为60 mg/mL，备用。

1.3.4 墨汁的配制

精确称量20 g阿拉伯树胶和10 g活性炭粉，量取160 mL蒸馏水，将阿拉伯树胶加入水中煮沸至透明，加入活性炭粉，煮沸3次。溶液冷却后，用蒸馏水稀释至 200 mL，备用[13]。

1.3.5 动物分组及给药

洛哌丁胺诱导的便秘模型主要是通过抑制肠道蠕动、影响肠道水代谢和肠神经系统而形成便秘[14]。实验设置空白对照组、模型对照组和阳性对照组（n=12），同时设置300、600、900 mg/（kg·d）3个滇橄榄水提物剂量组（n=12）。空白对照组灌胃0.9%生理盐水；模型对照组灌胃8 mg/（kg·d）洛哌丁胺；阳性对照组灌胃900 mg/（kg·d）的麻仁丸混悬液；3个剂量组分别灌胃相应浓度受试物和洛哌丁胺8 mg/（kg·d），所有样品采用0.9%生理盐水配制成所需浓度。连续7 d每日经口灌胃1次，灌胃量均为0.125 mL/10 g bw。

1.3.6 排便实验

根据《保健食品功能评价指导原则》开展小鼠排便实验。受试物干预的第6天晚上，对各组小鼠撤食不撤水。12 h后，给各剂量组灌胃生理盐水和相应受试物，并在1 h后对各组小鼠进行墨汁灌胃并开始计时。将灌胃完毕的小鼠分别置于独立笼内，给予充足水源，记录每只小鼠首粒排黑便时间，收集6 h内每只小鼠排出的粪便，统计其粒数和粪便总质量。实验结束后，将收集好的粪便样品置于真空干燥箱中，在50℃条件下干燥至恒重。按照公式：粪便含水率/%=[粪便湿重（g）-粪便干重（g）]/粪便湿重（g）×100，计算各组小鼠的粪便含水率。

1.3.7 小肠墨汁推进实验

根据《保健食品功能评价指导原则》开展小鼠小肠推进实验。灌胃相应受试物的第7天晚上，对各组小鼠进行饥饿处理。12 h后，各剂量组灌胃生理盐水和相应受试物。1 h后灌胃墨汁作为指示剂，20 min后立即处死小鼠，打开腹腔分离肠系膜，剪取自幽门至回盲部的肠组织，将小肠平铺，测量得到小肠长度，从幽门至墨汁前沿的长度为小肠墨汁推进距离。按照公式：小肠墨汁推进率/%=墨汁推进距离（cm）/小肠长度（cm）×100，计算各组小鼠的小肠墨汁推进率。

1.4 数据分析

采用Graphpad prism 8.0软件对实验数据进行统计分析。根据《保健食品功能评价指导原则》采用独立T检验（两尾法）分析组别间的差异显著性。若6 h内粪便总质量和6 h内粪便粒数其中一项结果阳性（p＜0.05），同时小肠墨汁推进率和首粒排黑便时间其中一项结果阳性（p＜0.05），即可判定该受试样品有助于通便。

2 结果与分析

2.1 滇橄榄水提物对便秘小鼠基础机体指标的影响

滇橄榄水提物对便秘小鼠基础机体指标的影响见图1。

图1 小鼠基础机体指标变化情况Fig.1 Changes in basic body indexes of mice

如图1所示，实验期间各组小鼠体质量均正常增长，摄食量、饮水量以及各脏器指数各组间无显著性差异（p>0.05）。表明滇橄榄水提物和各受试物未对小鼠基础机体指标造成明显影响。

2.2 滇橄榄水提物对便秘小鼠排便参数的影响

为明确滇橄榄水提物对便秘小鼠排便影响，在灌胃滇橄榄水提物等相应受试物的第7天进行排便实验，记录每组小鼠6 h内的粪便总质量和粪便粒数、首粒排黑便时间及粪便含水率，结果见图2。

图2 滇橄榄水提物对便秘小鼠排便的影响Fig.2 Effect of aqueous extract of P.emblica on defecation in mice with constipation

由图2可知，与空白对照组相比，模型对照组的6h内粪便总质量减少0.122 g（p＜0.05），首粒排黑便时间增加 61 min（p＜0.05），粪便含水率下降为 46%（p＜0.01），6 h内粪便粒数减少 4粒（p＜0.05），表明功能性便秘小鼠模型建立成功。

与模型对照组相比，滇橄榄水提物中、高剂量组小鼠的6 h内粪便总质量分别增加0.23（p＜0.01）、0.17 g（p＜0.05），粪便含水率分别增加至 64%、61%（p＜0.001），6 h内粪便粒数分别增加4粒和 5粒（p＜0.05），高剂量组首粒排黑便时间缩短80 min（p＜0.01）。结果表明，中、高剂量滇橄榄水提物对小鼠功能性便秘有较好的改善作用。

2.3 滇橄榄水提物对便秘小鼠小肠蠕动的影响

滇橄榄水提物对便秘小鼠小肠蠕动的影响见图3。

图3 滇橄榄水提物对便秘小鼠小肠蠕动的影响Fig.3 Effect of aqueous extract of P.emblica on intestinal peristalsis in mice with constipation

物质在小肠内的运动速率即胃肠道转运率为受试物是否具有润肠通便功效的重要参考。小肠墨汁推进率及小肠长度可反映滇橄榄水提物对便秘小鼠胃肠道转运率的影响。由图3A可知，各组小鼠小肠长度差异性不显著（p>0.05）。与空白对照组相比，模型对照组小鼠的小肠墨汁推进率降低至41%，两组间差异高度显著（p＜0.001）。与模型对照组相比，低、中、高剂量滇橄榄水提物均能显著提升小鼠小肠墨汁推进率，分别提升至57%、60%、65%，差异性均高度显著（p＜0.001），表明滇橄榄水提物可有效促进便秘小鼠小肠蠕动。

3 讨论与结论

便秘是一种常见的慢性胃肠道疾病，可分为功能性便秘和器质性便秘。功能性便秘是指无器质性或结构性疾病的硬便和少便[15]。心理压力、饮食或营养问题被认为是功能性便秘的主要诱导因素[16-17]。现阶段，西药和中成药是治疗功能性便秘的主要手段。这些药物可以通过抑制肠道炎症、改善肠道屏障系统、调节肠道菌群来恢复肠道微生态平衡，也可通过调节肠道组织水通道蛋白表达，提高内含物含水率起到润肠的作用，还可以调节肠神经系统，通过促进平滑肌活动和功能的恢复来促进肠道蠕动[18]。长期使用西药会引发多种副作用，而天然膳食制剂副作用小，与饮食结合，往往具有很好的治疗效果。

研究发现，香蕉低聚糖能改变肠道微生物菌落的组成，达到预防便秘效果[19]；葛仙米藻粉能够通过调节肠神经递质，如5-羟色胺、血管活性肠肽含量的分泌、水通道蛋白的表达改来善便秘症状[20]。裙带菜多糖及其寡糖通过调节肠道菌群失衡、修复肠道屏障的方式治疗便秘[21]；核桃青皮酵素可加强小鼠肠道蠕动，促进肠道的消化吸收，具有良好的润肠通便功效[22]。魔芋葡甘聚糖通过干预神经递质的表达，提高胃动素和乙酰胆碱酯酶水平，降低内皮素、5-羟色胺和NO水平，能有效缓解便秘患者的临床症状[23]；天然产物浒苔多糖通过上调结肠5-羟色胺的表达能够改善洛哌丁胺诱导的小鼠便秘症状[24]。采用食品或天然提取物防治便秘已经成为一种趋势。

本研究采用洛哌丁胺诱导便秘小鼠模型，从粪便性状和肠道蠕动两个方面研究滇橄榄水提物的润肠通便作用。研究结果表明，与模型对照组小鼠相比，中、高剂量滇橄榄水提物[600、900 mg/（kg·d）]可显著促进便秘小鼠的小肠蠕动，首粒排黑便时间缩短（其中高剂量组差异极显著），6 h内粪便总质量和粪便粒数以及粪便含水率显著增加，小肠墨汁推进率显著提升，通便效果与麻仁丸接近。滇橄榄水提物在促进肠道蠕动及增加粪便含水量方面存在显著作用，说明滇橄榄润肠通便作用可能与肠道水通道蛋白、神经递质调节有关。推测滇橄榄水提物通过调节水通道蛋白3和水通道蛋白4的表达，改变肠道组织水分吸收方式，进而改善便秘。此外，研究表明滇橄榄水提物对小鼠饮食、体质量以及脏器指数均无显著影响，实验期间小鼠未出现腹泻、精神状态不佳等明显毒副作用，表明滇橄榄水提物具有较好的安全性。滇橄榄水提物可显著改善洛哌丁胺诱导的小鼠便秘症状，具有可靠、温和的润肠通便功效。