灵芝醇提物对改善3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的作用

谭孟芳，康信聪，3，4，周佳丽，杨兰，刘东波，3，4*

（1.湖南农业大学园艺学院，湖南长沙410128；2.国家中医药管理局亚健康干预技术实验室，湖南 长沙 410128；3.湖南作物种质创新与资源利用重点实验室，湖南 长沙 410128；4.植物功能成分利用省部共建协同创新中心，湖南 长沙 410128）

胰岛素抵抗，即胰岛素效应细胞（如脂肪细胞等）对胰岛素不敏感[1]，是2型糖尿病、高血压、肥胖、动脉粥样硬化等常见代谢综合征的共同病理[2]。正常生理状态下，胰岛素能促进脂肪细胞的葡萄糖摄取以及脂肪合成，抑制脂肪分解[3]；当脂肪细胞产生胰岛素抵抗，胰岛素无法很好地抑制脂肪分解，机体脂解速率上升，血浆中游离脂肪酸水平升高形成高血脂，同时游离脂肪酸异位聚积于其他组织，造成外周组织及全身的胰岛素抵抗[4]。

灵芝，真菌担子菌亚门、层菌纲、多孔菌目、多孔菌科、灵芝属药用真菌[5]，在《神农本草经》中被列为上品[6]。灵芝在我国有上百年的食用历史，最新被纳入“药食同源”名单[7]。研究表明，灵芝及其活性成分对糖尿病患者及动物模型有明显的降血糖、增加胰岛素分泌、改善糖耐量、调节血脂、延缓糖尿病并发症的作用[5]。灵芝醇提物（alcohol extract of Ganoderma lucidum，GLAE）具有减少脂肪细胞脂质积累、减少脂肪细胞分化的作用[8]，然而，目前并未有灵芝醇提物改善脂肪细胞胰岛素抵抗的研究报道。本研究以地塞米松诱导建立脂肪细胞胰岛素抵抗模型，二甲双胍（metformin，MET）为阳性对照，探究灵芝醇提物对脂肪细胞胰岛素抵抗的影响及其分子机制，为灵芝资源的开发利用提供实验证据。

1 材料

1.1 细胞株

3T3-L1小鼠前脂肪细胞株：中国科学院干细胞库（编号：scsp-5038）。

1.2 药物与试剂

赤芝子实体：长沙九峰生物科技有限公司，经湖南农业大学亚健康干预技术实验室刘东波教授鉴定为赤芝，药材符合2020年版《中国药典》规定。

二甲双胍：阿达玛斯试剂公司；DMEM培养基、磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）：BI生物公司；地塞米松（dexamethasone，DEX）、二甲基亚砜：美国西格玛奥德里奇公司；胰岛素（insulin，ins）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）凝胶快速配制试剂盒、兔二抗、鼠二抗、一抗稀释液、二抗稀释液：北京碧云天生物技术公司；CCK-8试剂盒：南京诺唯赞生物科技有限公司；葡萄糖氧化酶法测定试剂盒、甘油三酯试剂盒：南京建成生物工程研究所；3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（1-methyl-3-isobutylxanthine，IBMX）、油红“O”试剂盒、30%凝胶储备液AB液：北京索莱宝生物科技有限公司；0.25%胰蛋白酶、双抗（pen strep）：美国 Gbico公司；显影液：美国Millipore公司；聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）：美国 Pall Corporation 公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GADPH）：上海普迈生物科技有限公司；磷脂酰肌醇-3-激酶 p110亚基（Phosphatidylinositol-3-kinasep110，PI3Kp110）、磷脂酰肌醇-3-激酶 p85 亚基（Phosphatidylinositol-3-kinase-p85，PI3Kp85）一抗、蛋白激酶（phosphorylated protein kinase，AKT）、Phospho-AKT（Ser473）一抗、糖原合酶激酶 3β（glycogen synthase kinase-3β，p-GSK3β）、Phospho-GSK3β（Ser389）一抗 、胰岛素受体底物1（recombinant insulin receptor substrate 1，IRS1）一抗：莱恩生物科技有限公司；葡萄糖转运体-4（glucose transporters-4，GLUT-4）：武汉菲恩生物科技有限公司。

1.3 主要仪器

3503-2 二氧化碳细胞培养箱：美国Shellab公司；AE2000荧光倒置显微镜：麦克奥迪电气股份有限公司；2-16R高速冷冻离心机：湖南恒诺仪器设备有限公司；Multiskan Mk3型酶标仪：赛默飞世尔仪器有限公司；UV2000紫外分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；DK-98-ⅡA电热恒温水浴锅、800YY型中草药粉碎机：永康市铂欧五金制品有限公司；Spark多功能酶标仪：瑞士TECAN；RE-52A旋转蒸发仪：上海雅荣生化仪器设备公司；101-4AB电热恒温干燥箱：北京中星伟业仪器有限公司；2-16R离心机：湖南恒诺仪器设备有限公司；XS205专业型分析天平：梅特勒-托利多仪器有限公司。

2 方法

2.1 灵芝醇提物制备

灵芝子实体，粉碎，过10目筛，取过筛灵芝子实体粉末100g，以80%的乙醇作为提取试剂，料液按照质量比1∶20，提取温度为 70℃，回流提取3次，每次1.2 h[9]。过滤，合并滤液，用旋转蒸发仪进行浓缩，得灵芝醇提物浸膏，蒸干浸膏得到灵芝醇提物1.146 g。

2.2 3T3-L1前脂肪细胞培养与诱导分化

细胞培养：将3T3-L1前脂肪细胞用含10%胎牛血清和1%青链霉素的DMEM高糖培养基（以下简称完全培养液）于37℃、5% CO2的培养箱中进行培养，每2 d进行一次换液处理。

诱导分化：取对数生长期的细胞接种于培养板，待细胞长满后，使其接触抑制48 h。48h过后，换入成脂诱导剂一（含 0.5 mmoL/L IBMX，0.25 μmoL/L DEX，1 mg/L胰岛素，2 μmoL/L罗格列酮的完全培养液）培养48h，到达处理时间后，换入成脂诱导剂二（含1mg/L胰岛素的完全培养液）继续培养48 h完成诱导[10]。后续更换为完全培养液，每2 d换液1次，继续培养8天，待有占比90%以上细胞出现“戒环”状脂滴即可用于试验。

2.3 油红“O”染色

使用油红“O”染色法鉴定3T3-L1细胞的分化程度[11]。饱和油红氧按照体积比3∶2（油红氧∶蒸馏水）加入蒸馏水配制成油红“O”的工作液，混匀，室温放置5 min～10 min，过滤后使用。去除细胞板中的完全培养基，PBS洗涤3次，使用甲醛-钙固定10 min，蒸馏水充分洗涤，60%异丙醇侵洗，油红“O”染液染色10 min，60%异丙醇分化至间质清晰，Mayer苏木素复染1 min，蒸馏水洗，使用倒置显微镜拍照观察。

2.4 灵芝醇提物对脂肪细胞存活率的影响

通过CCK8试剂盒测定细胞活力。细胞以5×103个/孔的密度接种于96孔板中，待贴壁以后，使用10、50、10、500、1 000 mg/L 的灵芝醇提物处理 24 h，处理时间到达后换入10%CCK8检测液，继续培养1 h，于

2.5 脂肪细胞胰岛素抵抗模型建立

细胞以5×103个/孔接种于96孔培养板中，分为正常组与建模组，正常组使用完全培养基培养，建模组使用1 μmol/L的地塞米松，分别处理脂肪细胞24、48、72 h，处理时间到达后，选择加入或者不加100 nm的胰岛素刺激脂肪细胞30 min。刺激结束后取出培养液，采用葡萄糖氧化酶法检测葡萄糖含量，计算出葡萄糖消耗量，计算公式：葡萄糖消耗量/（mmol/L）＝原DMEM培养基葡萄糖含量-实验组培养基葡萄糖含量。

培养板继续加入10%CCK8检测液，孵育1 h，在450 nm波长处检测吸光度，计算出细胞存活率，计算公式同2.4。

2.6 模型稳定性检测

建立胰岛素抵抗模型后，将正常组与模型组同时在完全培养基中孵育24 h，孵育完成后检测细胞存活率以及葡萄糖消耗量，检测方法同2.4和2.5。

2.7 灵芝醇提物处理胰岛素抵抗模型

为了说明灵芝醇提物对地塞米松诱导的胰岛素抵抗模型的影响，选择10、50、100 mg/L 3个浓度的灵芝醇提物在胰岛素抵抗模型中进行剂量反应分析。实验设置正常组，模型组，低、中、高剂量灵芝醇提物给药组（浓度分别为10、50、100 mg/L灵芝醇提物），二甲双胍阳性对照组（浓度为100 mg/L）。加药物24 h后吸出培养液，使用葡萄糖氧化酶法检测培养液中葡萄糖含量，计算出各组葡萄糖消耗量，计算方法同2.5。

2.8 甘油三脂含量检测

细胞处理与分组方法同2.7。处理完成后收集细胞，使用裂解液裂解细胞30 min，采用甘油三酯试剂盒检测甘油三酯的含量，计算公式：甘油三酯含量/（mmol/L）＝实验组吸光度/正常组吸光度×标准品浓度/实验组蛋白浓度。

2.9 Western blot检测

实验设置正常组，模型组（1 μmoL/L地塞米松的完全培养基处理脂肪细胞72 h），治疗组（1 μmoL/L地塞米松处理脂肪细胞72 h后使用10 mg/L灵芝醇提物的完全培养基处理24 h）。利用 Western blot法，以GAPDH为内参蛋白，检测IRS1、GLUT4、PI3Kp110、PI3Kp85、AKT，p-AKT（Ser473）、GSK3β，p-GSK3β（Ser-389）蛋白表达水平。

细胞培养板放置于冰面上，弃去培养板中的培养450 nm波长处检测吸光度，计算细胞存活率，计算公式如下。基，加入PBS洗涤2次，加入蛋白裂解液裂解10 min，用枪吹打裂解液使细胞裂解完全。收集裂解液，4℃离心，14 000 r/min离心3 min取上清，加入5倍上样缓冲液，100℃金属浴10min。BCA法测定蛋白浓度。配制10%的SDS-PAGE凝胶分离蛋白；使用湿转法（250 mA，1.5 h）将蛋白质转移至0.22 μm PVDF膜上，转膜结束后PVDF膜加入封闭液封闭1 h；使用1×TBST洗PVDF膜3次，每次10 min；加入一抗蛋白4℃过夜，回收一抗，1×TBST洗PVDF膜3次，每次10 min；加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔或者抗鼠孵育1 h，充分洗涤，加入显影液，放入化学发光凝胶成像仪检测[12]。

2.10 数据统计分析

所得结果使用SPSS软件进行统计学分析，实验数据采用t检验统计分析。

3 结果

3.1 3T3-L1成熟脂肪细胞的诱导

3T3-L1成熟脂肪细胞的诱导见图1。

图1 脂肪细胞诱导Fig.1 Adipocyte induction

细胞生长密度占比达80%以上后使细胞保持接触抑制状态2 d，细胞退出生长周期，形状为细条形的梭状。诱导分化的第2天，细胞由梭状开始变圆（图1A），诱导分化的第6天，大量细胞变圆（图1B）。诱导分化的第10天，细胞有圆形大脂滴聚集在细胞中心，少量细胞呈现出“戒环”状结构的形状（图1C）。第12天时，分化为成熟的3T3-L1脂肪细胞占比90%以上，脂滴分布于细胞质中，出现“戒环”状结构（图1D）。油红“O”染色可观察到脂肪细胞中油脂呈红色，细胞核呈蓝色，间质无色，红色的脂滴呈“戒环”状分布于细胞中（图1E、1F）。上述实验结果表明，3T3-L1前脂肪细胞已经成功分化为成熟的脂肪细胞。

3.2 灵芝醇提物对脂肪细胞活力的影响

灵芝醇提物对脂肪细胞活力的影响如图2所示。

图2 灵芝醇提物对细胞存活率的影响Fig.2 Effect of Ganoderma lucidum ethanol extract on cell survival rate

如图2所示，500、1 000 mg/L灵芝醇提物处理组与正常组相比较极显著降低（P＜0.01）。10、50、100 mg/L灵芝醇提物处理组的细胞存活率没有统计学差异（P＞0.05），对脂肪细胞没有毒性。因此，后续实验选择10、50、100 mg/L进行实验。

3.3 胰岛素抵抗模型建立

胰岛素抵抗模型建立结果如图3所示。

图3 建立胰岛素抵抗模型Fig.3 Insulin resistance model

通过脂肪细胞葡萄糖消耗量来判断脂肪细胞胰岛素抵抗程度，1 μmoL/L地塞米松处理的3T3-L1细胞，脂肪细胞葡萄糖消耗量随着地塞米松处理的时间增加而逐渐减少（图3B）。在24、48 h内与正常组比无极显著差异，在72 h时与正常组相比细胞葡萄糖消耗量出现极显著抑制（P＜0.01）。因此选择1 μmoL/L的地塞米松处理72 h为模型组。地塞米松处理组与正常组比较细胞存活率并没有显著性的差异，排除细胞死亡产生的实验干扰（图3A）。

3.4 模型稳定性

模型稳定性结果见图4。

图4 模型稳定性分析Fig.4 Model stability analysis

1 μmoL/L地塞米松处理脂肪细胞72 h建立胰岛素抵抗模型组，使用完全培养基继续孵育24 h，模型组与正常组相比，脂肪细胞的葡萄糖消耗量极显著被抑制（P＜0.01）（图4），表明 24 h内该模型维持稳定。

3.5 灵芝醇提物改善脂肪细胞的胰岛素抵抗

灵芝醇提物改善脂肪细胞的胰岛素抵抗结果见图5。

图5 灵芝醇提物改善胰岛素抵抗Fig.5 Ganoderma lucidum ethanol extract improves insulin resistance

如图5所示，灵芝醇提物给药干预24 h后，10、50、100 mg/L灵芝醇提物均促进了脂肪细胞胰岛素抵抗模型的葡萄糖消耗，分别为20.6%、33.7%、40.6%（图5B）。灵芝醇提物能显著逆转地塞米松导致的胰岛素抵抗且具有剂量依赖性。各组细胞使用CCK8测定细胞活力，细胞存活率没有统计学差异（图5A）。由此说明，灵芝醇提物确实能改善地塞米松诱导的胰岛素抵抗。

3.6 灵芝醇提物促进脂肪细胞脂质积累

灵芝醇提物对脂肪细胞甘油三酯的影响如图6所示。

图6 灵芝醇提物对甘油三酯的影响Fig.6 Effect of Ganoderma lucidum ethanol extract on triglyceride

经过地塞米松处理之后，模型组细胞甘油三酯含量与正常组相比极显著下降（P＜0.01）。灵芝醇提物处理细胞24 h显著增加了脂肪细胞的甘油三酯含量且呈现剂量依赖性（P＜0.05）。由此说明，灵芝醇提物可以改善脂肪细胞胰岛素抵抗，改善脂肪细胞脂质代谢紊乱。

3.7 灵芝醇提物改善脂肪细胞胰岛素抵抗相关蛋白的表达

蛋白表达结果见图7。

图7 灵芝醇提物对胰岛素信号通路的影响Fig.7 Effect of Ganoderma lucidum ethanol extract on insulin signaling pathway

灵芝醇提物处理脂肪细胞胰岛素抵抗模型24 h，Western blot法检测 IRS1、GLUT4、PI3Kp110、PI3Kp85、AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β 蛋白的表达。与正常组比较，模型组细胞的 IRS1、GLUT4、PI3Kp110、PI3Kp85、p-AKT、p-GSK3β蛋白表达明显下降；灵芝醇提物处理 24 h 后 IRS1、GLUT4、PI3Kp110、PI3Kp85、p-AKT、p-GSK3β蛋白表达上升。结果表明，灵芝醇提物能通过改善脂肪细胞胰岛素抵抗模型IRS1、GLUT4、PI3Kp110、PI3Kp85、p-AKT、p-GSK3β 蛋白的表达改善脂肪细胞胰岛素抵抗。

4 讨论与结论

胰岛素抵抗在脂肪细胞中主要表现为脂肪细胞糖摄取、脂肪合成的减少及对脂解作用抑制的减弱[4]。脂肪组织胰岛素抵抗是代谢紊乱疾病的主要病理特征之一[4]。随着生活质量的提高，代谢紊乱疾病发病率逐年上升[13]。改善脂肪细胞胰岛素抵抗对于改善代谢紊乱疾病十分重要。

地塞米松是糖皮质激素的一种，而糖皮质激素是胰岛素抵抗的有效激活剂和胰岛素分泌的抑制剂，地塞米松诱导3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗使用较早，是经典的模型[5]。使用地塞米松处理脂肪细胞的时间越长胰岛素抵抗效果越强，本试验中地塞米松处理脂肪细胞72 h时胰岛素抵抗程度最高，与Luan等[14]的结果一致。IRS-1、PI3K 和 AKT（IRS1/PI3K/AKT）信号通路是胰岛素信号转导的主要途径[15]。在正常的脂肪细胞中，胰岛素与胰岛素受体相互作用后，IRS-1被激活，启动下游信号转导通路PI3K和AKT信号通路[15]。p-AKT调节糖原合成酶激酶-3β的活性，最终刺激脂质的合成[16]。本试验结果显示，地塞米松处理脂肪细胞72 h 后 IRS1、GLUT4、PI3Kp110、PI3Kp85、p-AKT、p-GSK3β蛋白表达下降，与Yang等[17]结果一致，地塞米松引起脂肪细胞胰岛素抵抗主要是由于胰岛素受体损伤、PI3K活化受损以及葡萄糖转运蛋白受损[18]。

灵芝具有抗肿瘤、增强免疫功能、降血糖等多种药理作用[6]。有研究表明灵芝颗粒可以通过减轻机体炎症状态治疗2型糖尿病，可明显降低2型糖尿病患者的血糖水平，有效改善胰岛素抵抗[19]。本实验中10、50、100 mg/L的灵芝醇提物均促进了葡萄糖消耗量以及甘油三酯的积累，促进程度与灵芝醇提物剂量呈正比。Western blot结果显示，灵芝醇提物促进了IRS1的表达，改善了模型组胰岛素受体损伤；激活了PI3K/AKT，促进胰岛素信号转导；增加了GLUT4蛋白的表达，促进了葡萄糖转运；激活了GSK3β，促进脂肪细胞脂质的合成。

综上所述，灵芝醇提物可有效改善脂肪细胞的胰岛素抵抗且呈现剂量依赖性。其作用机制可能是通过激活IRS1/PI3K/AKT通路，促进葡萄糖的吸收，促进脂质合成，改善了脂肪细胞胰岛素抵抗以及糖脂代谢紊乱。本研究讨论了灵芝醇提物改善胰岛素抵抗的分子机制，为灵芝的临床使用及综合利用提供理论基础。然而，灵芝醇提物改善胰岛素抵抗相关机制的研究以及临床应用还需大量学者的努力。