小鼠肝炎病毒逆转录-重组酶聚合酶扩增检测方法的建立、验证及应用

闫雪，李明，张旭，张振，王霄，马跃宇，马鸣潇，费东亮

1.锦州医科大学畜牧兽医学院，辽宁 锦州 121000；2.锦州市疾病预防控制中心，辽宁 锦州 121000

小鼠肝炎病毒（mouse hepatitis virus，MHV）属于冠状病毒科冠状病毒属，单股正链RNA 病毒，具有极强的传染性，不仅造成乳鼠死亡，还可引起成年小鼠免疫应答参数的改变，严重干扰实验结果［1］。根据实验动物微生物等级及监测标准（GB14922-2011），MHV 为 SPF 级小鼠必检清除项之一［2-3］。

目前，MHV 检测方法主要有病毒分离与电子显微镜观察、血清学和分子生物学方法，其中以ELISA和RT-qPCR 法最为常用。ELISA 法虽准确度高，但操作复杂，敏感性低，对实验人员技术要求较高［4-5］；RT-qPCR 法具有良好的特异性、灵敏性和可靠性，也是各实验室对该病毒检测的常用参考方法，但该方法对温度控制和操作流程要求严格，需昂贵实验设备，使其应用受限［6-8］。作为PCR 的替代技术，重组酶聚合酶扩增（recombinase ploymerase amplification，RPA）技术是以T4 噬菌体核酸复制机制为主要反应原理，利用重组酶、单链结合蛋白和DNA 聚合酶的催化作用，实现目的基因在恒温条件（25 ～42 ℃）下的快速扩增，20 min 即可获得扩增产物，且无需其他仪器设备［9-10］。该技术已在病毒的快速检测中得到了广泛应用，如中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS）、埃博拉病毒（Ebola virus，EV）、犬瘟病毒（canine distemper virus，CDV）、口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDS）、禽流感病毒（bird flu virus，BFV）、布鲁菌（Brucella）、戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）、猪伪狂犬病毒（pigpseudorabiesvirus，PPRV）及仙台病毒（Sendaivirus，SV）等［11-17］，但将 RPA 技术应用于 MHV 快速检测鲜见报道。因此，本研究基于RPA 技术建立一种用于检测 MHV 的逆转录-RPA（RT-RAP）法，为 MHV 的现场检测及风险监测提供快速检测方法。

1 材料与方法

1.1 样本 32 份野外田鼠肝脏组织样本由锦州疾病预防控制中心提供。

1.2 毒株、菌株及质粒 MHV、鼠肺炎病毒（pneumonia virus of mice，PVM）、SV、鼠汉坦病毒（Hantaan virus，HV）、鼠细小病毒（minute virus of mice，MVM）、呼肠弧病毒Ⅲ型（reovirus typeⅢ，ReoⅢ）cDNA 由北京大学实验动物部白英杰教授惠赠；E.coli BL21（DE3）购自北京全式金生物技术有限公司；标准质粒pET-MS2-M（MHV）由江苏金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 主要试剂 病毒DNA／RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒及DL2000 DNA marker 均购自北京全式金生物技术有限公司；Twist AmpTMBasic ki（tTABAS03KIT）购自英国TwistDX 公司。

1.4 方法的建立 以GenBank 中登录的MHV-FJ 株（FJ6647223）M 基因中保守区段（82 ～ 317 bp）为靶基因，设计RPA 特异性引物，以标准质粒pET-MS2-M（MHV）为模板进行RPA 扩增。扩增体系为：Rehydra-tion Buffer 29.5 μL，上下游引物（终浓度为10 μmol ／ L）各 2.4 μL，模板 2 μL，去离子水补齐至47.5 μL，再加入醋酸镁（终浓度为 280 mmol ／ L）2.5 μL，共50 μL。等温扩增。反应产物中加入100 μL苯酚 ／ 氯仿提取剂，1 204 × g 离心 10 min；取上清10 μL，与 2 μL DNA Loading Buffer 混合，经 1.4%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.5 方法的优化

1.5.1 引物的确定 设计6 对RPA 特异性引物，引物序列见表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。分别使用6 对引物按1.4 项方法进行检测，反应温度为39 ℃，反应时间为30 min。

表1 用于RPA 检测的引物序列Tab.1 Primer sequences for RPA

1.5.2 反应温度的确定 分别于 31、33、35、37、39、41 ℃条件下，采用最适引物，按1.4 项方法进行检测，反应时间为30 min。

1.5.3 反应时间的确定 将反应时间分别设定为20、25、30、35 min，采用最适引物，按 1.4 项方法进行检测，反应温度为37 ℃。

1.6 方法的验证

1.6.1 敏感性 将标准质粒pET-MS2-M（MHV）进行10 倍系列稀释，4.75 × 101～ 4.75× 106copies／μL共6 个梯度，采用优化方法进行检测，验证该方法的敏感性。

1.6.2 特异性 分别以 MHV、PVM、SV、HV、MVM、ReoⅢ cDNA 为模板，采用优化方法进行检测，验证该方法的特异性。

1.7 方法的应用 取32 份野外田鼠肝脏组织样本，采用病毒DNA／RNA 提取试剂盒提取总RNA，反转录合成cDNA，以其为模板，采用优化方法进行检测。同时采用RT-qPCR 法进行检测，PCR 反应条件为：94 ℃ 2 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s；共30 个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃ 2 min。对两种方法进行比较。

2 结 果

2.1 方法的优化

2.1.1 最适引物 设计的6 对RPA 引物均可扩增出约200 bp 的目的条带，以M-MHV-2 的扩增条带亮度最强，且无非特异性条带，见图1。因此，确定最适引物为引物2。

图1 RPA 扩增引物的优化Fig.1 Optimization of primers for RPA

2.1.2 最适反应温度 反应温度为 31、33、35、37、39、41 ℃时均可扩增出约200 bp 的目的条带，反应温度为37 ℃时，扩增条带最清晰，见图2。因此，确定最适反应温度为37 ℃。

图2 RPA 扩增反应温度的优化Fig.2 Optimization of temperature for RPA

2.1.3 最适反应时间 反应时间为 20、25、30、35 min时均可扩增出约200 bp 的目的条带，反应时间为30和35 min 时，目的条带亮度最强，差异较小，见图3。为节约时间，确定最适反应时间为30 min。

图3 RPA 扩增反应时间的优化Fig.3 Optimization of time for RPA

2.2 方法的验证

2.2.1 敏感性 4.75 × 101～ 4.75 × 106copies ／ μL标准质粒 pET-MS2-M（MHV）中，4.75 × 102～ 4.75 ×106copies／μL 可扩增出约 200 bp 的目的条带，4.75 ×101copies ／ μL 未见该目的条带，见图 4。因此，确定该方法的检测下限为4.75×102copies／μL。

图4 RT-RPA 法敏感性的验证结果Fig.4 Verification for sensitivity of RT-RPA

2.2.2 特异性 MHV、PVM、SV、HV、MVM、ReoⅢ中，仅有MHV cDNA 可扩增出约200 bp 的目的条带，其他病毒均未扩增出该条带，见图5。表明该方法具有良好的特异性。

图5 RT-RPA 法特异性的验证结果Fig.5 Verification for specificity of RT-RPA

2.3 方法的应用 32 份野外田鼠肝脏组织样本中，RT-RPA 法检出1 份阳性样本，阳性率为3.13%（1 ／32），与RT-PCR 法结果一致，表明两种方法具有较好的一致性。

3 讨 论

MHV 主要通过空气和接触进行传播，无明显季节性，通常表现为隐形感染，在应激情况下表现为致死性肝炎、肠炎等，主要传播途径包括感染小鼠分泌物、粪便、尿液和污染的器具。MHV 是我国SPF 级别或该级别以上实验小鼠必须排除的病原之一，在国家标准《实验动物微生物学等级及监测》（GB 14922.2-2011）规定中作为必检项目，2013年首次被纳入新版《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》［1-2］。

实验小鼠感染MHV 非常普遍，根据组织嗜性不同，可分为呼吸毒株和肠毒株。目前，针对MHV分子诊断方法主要基于PCR 技术建立起来的各种RT-PCR 检测方法，该类方法具有快速、特异性高等优点，但需要复杂的热循环系统，因此该方法虽在实验室检测中广泛应用，但在现场检测中无法推广应用。等温扩增技术可在恒温或室温下进行核酸复制，大幅缩短了时间成本，具备高效便捷的优点，其中又以RPA 技术应用最广泛［18-22］。本实验建立的MHV RT-RPA 检测方法在37 ℃条件下30 min 即可完成检测，最低检测下限为 4.75 × 102copies ／ μL。特异性验证结果显示，仅有MHV cDNA 作为模板出现目的条带，而其他病毒cDNA 模板均为阴性，无非特异条带出现，表明该方法具有良好的特异性。另外，该检测方法也降低了对温控设备的依赖，大幅缩短了反应时间，表明该方法有望应用于基层的MHV检测。对临床样本检测结果与RT-PCR 方法具有良好的一致，表明该方法具有良好的准确性。

综上所述，本研究建立了能够快速、高效检测MHV 的RT-RPA 方法，该方法具有良好的特异性及敏感性，反应快速、节省时间，在实验动物质量检测方面具有良好的应用前景，也为进一步研发侧流层析试纸条等MHV 相关快速检测方法奠定了基础。