新规格冻干甲型肝炎减毒活疫苗的免疫原性及安全性评价

徐艳玲，王艺博，侯丽娟，李勇，岳立广，夏青娟，申文晋，张春云，范明源，刘令九，邹勇

1.长春生物制品研究所有限责任公司，吉林 长春 130012；2.天津药物研究院新药评价有限公司，天津300301

甲型肝炎（简称甲肝）是由甲肝病毒引起的一类高发病率的病毒性传染病［1］，严重危害人类健康，全球每年报告发病约20 万例，主要暴发于卫生条件和社会经济条件较差的发展中国家［2-4］，也有报道显示，在卫生条件和卫生习惯较差的发达国家，20% ~25%的肝炎病例与甲肝有关［5］。甲肝较少致命，感染严重程度通常随着年龄的增长而增加，仅有少于1%的甲肝患者，特别是老年或患有慢性肝病的患者发生死亡，2016年，经 WHO 统计，全球有 7 000 多人死于甲肝［6-7］。WHO 推荐预防甲肝的最有效方法是接种甲肝疫苗［8］。我国是甲肝流行较严重的国家之一，具有较高的发病率及感染率，随着经济的发展和甲肝疫苗的应用，甲肝的发病率和感染率已明显下降［9-10］，但在中西部地区，甲肝发病率仍较高，因此甲肝的预防仍不容忽视［11-13］。

长春生物制品研究所有限责任公司生产的冻干甲型肝炎减毒活疫苗（L-A-1 减毒株，简称甲肝减毒活疫苗）每剂复溶后为1.0 mL，该规格已上市应用近20年，具有良好的安全性和免疫效果［14］。2008年，冻干甲型肝炎减毒活疫苗纳入国家免疫规划，接种对象为18 个月龄以上的儿童。国家计划免疫一类疫苗（包括糖丸及其他剂型）中，规格为每剂0.5 mL的疫苗有15 个，占比58%，表明0.5 mL 规格的疫苗是计划免疫中疫苗发展的趋势，更有利于计划免疫的接种和实施。因此，长春生物制品研究所有限责任公司优化了甲肝减毒活疫苗稳定剂配方，将疫苗规格由复溶后每剂1.0 mL 变更为0.5 mL。本研究对变更后的甲肝减毒活疫苗的免疫原性和安全性进行评价，为该疫苗的进一步应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 原液及疫苗 复溶后为每剂0.5 mL 的甲肝减毒活疫苗试验疫苗（于-60 ℃以下保存，各项检测指标均合格，批号为：S20140301、S20140302、S20140303）及复溶后每瓶1.0 mL 的市售甲肝减毒活疫苗（批号为：20140723、20140724、20140725）均由长春生物制品研究所有限责任公司提供。

1.2 主要试剂及仪器 甲型肝炎病毒抗原检测试剂盒购自北京北方生物技术研究所有限公司；牛血清白蛋白ELISA 定量检测试剂盒购自无锡博生医用生物技术开发有限公司；甲型肝炎病毒抗体诊断试剂盒购自浙江省医学科学院；气相色谱仪（型号：G1530A）购自安捷伦科技有限公司。

1.3 实验动物 SPF 级 NIH 小鼠，雌雄各半，3 ～ 4周龄，体重14 ～16 g，由长春生物制品研究所有限责任公司动物室提供，动物许可证号为：SCKK（吉）-2011-0003；SPF 级 SD 大鼠，雌雄各半，5 ～ 6 周龄，体重145 ～173 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号为：11400700116922；普通级日本大耳白家兔，雌雄各半，体重2.095 ～2.665 kg，12 ～20 周龄，购自北京隆安实验动物养殖中心，动物合格证号为：11401400000676。本实验对动物的所有处理均以科研为目的进行养殖和使用，且按照动物伦理相关规定进行。

1.4 免疫原性试验 将NIH 小鼠随机分为8 组，每组20 只（雌雄各半）。其中6 组分别注射批号为S2014-0301、S20140302、S20140303 的试验疫苗及批号为20140723、20140724、20140725 的市售疫苗，免疫剂量分别为0.5 和1.0 mL／只，同时设阴性对照组（0.9%氯化钠，0.5 mL ／ 只）及空白对照（不作任何处理）。各组小鼠均经腹腔免疫，免疫28 d 后经心脏采血，分离血清，用甲肝病毒抗体诊断试剂盒检测血清中甲型肝炎病毒抗体滴度。取抗体滴度以2 为底数的对数，计算各组的抗体几何平均滴度及标准差。

1.5 急性毒性试验 将SD 大鼠随机分为3 组，每组20 只（雌雄各半）。其中2 组分别注射试验疫苗（批号为：S20150814）及市售疫苗（批号为：20140723），注射体积分别为1 和2 mL ／ 只，均经背部2 点皮下注射，每点相应分别注射0.5 和1.0 mL ／ 剂，同时设阴性对照组（0.9%氯化钠溶液，注射剂量及途径同试验疫苗）。给药后每日观察大鼠毒性反应情况，共观察28 d，记录每组动物死亡情况。于给药前及给药后 1、3、7、14、21、28 d 称重，观察体重变化。在试验过程中发生死亡和濒死的动物应及时进行解剖检查，给药后28 d 对所有存活大鼠均进行大体剖检。

1.6 刺激性试验

1.6.1 动物分组及给药 将18 只家兔随机分为3组，每组6 只（雌雄各半）。其中2 组分别注射试验疫苗（批号为：S20150814）及市售疫苗（批号为：2014-0723），均经背部皮下注射，注射体积分别为0.5 和1.0 mL ／（剂·只），同时设阴性对照组（0.9%氯化钠溶液，经背部皮下注射，0.5 mL ／ 只）。

1.6.2 体重检测 于给药前及给药后3、4、23 d 称量各组家兔体重，观察体重变化。

1.6.3 皮肤刺激反应评分 于给药前及给药后24、48、72 h，观察家兔的反应及注射部位皮肤的刺激反应，对注射部位皮肤（外观）按红斑（无红斑、勉强可见、明显可见、中度至严重红斑、紫红色红斑并有焦痂形成的分值分别为 0、1、2、3、4 分）和水肿［无水肿、勉强可见、可见（边缘高出周围皮肤）、皮肤隆起约1 mm 且轮廓清楚、水肿隆起1 mm 以上且范围扩大的分值分别为 0、1、2、3、4 分］情况进行评分。计算各时间点的反应分值均值，≤2 判为符合规定，＞2判为不符合规定。

1.6.4 解剖及组织病理学检查 于给药后4 d（每组随机取3 只家兔）及23 d（每组剩余3 只家兔）剖检，取背部给药部位及其周围的皮肤和肌肉。观察注射部位皮肤、皮下组织及肌肉的刺激反应，计算每个剂量组给药部位刺激反应级数的平均分值，无明显变化、轻度（充血范围在0.5 cm×1.0 cm 以下）、中度（充血范围在 0.5 cm × 1.0 cm 以上）、重度（充血伴有肌肉变性）、出现坏死有褐色变性、出现肌肉严重变性及广泛性坏死的分值分别为 0、1、2、3、4、5 分。同时，将剖检样品经固定、脱水及石蜡包埋等处理后，进行3 μm 厚度切片，HE 染色，显微镜下观察。

1.7 统计学分析 应用SPSS 19.0 统计学软件进行统计学分析，试验数据采用均值 ± 标准差（）表示，各组间比较采用单因素方差分析和t 检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 免疫原性试验 3 批试验疫苗和市售疫苗免疫后，小鼠血清抗体阳转率均为100%，阴性对照及空白对照阳转率均为0。批号为S20140301、S20140302、S20140303 的试验疫苗及批号为 20140723、2014-0724、20140725 的市售疫苗组小鼠血清抗体平均滴度分别为 8.88 ± 0.65、8.88 ± 0.55、8.57 ± 0.54、8.28 ± 0.69、8.88 ± 0.67、8.57 ± 0.59，试验疫苗组与市售疫苗组比较，差异无统计学意义（F=0.208，P ＞ 0.05）。

2.2 急性毒性试验

2.2.1 体重 给药后28 d 观察期内各组均未见大鼠死亡及其他异常反应。与给药前比较，给药后1、3、7、14、21 和 28 d，试验疫苗组、市售疫苗组、阴性对照组大鼠的平均体重均呈增长趋势；试验疫苗组及市售疫苗组大鼠平均体重与同期同性别阴性对照组比较，差异均无统计学意义（t = 0.398 ~ 1.718，P均 ＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠体重变化（g，，n = 10）Tab.1 Changes of bodyweights of mice rats in various groups（g，，n = 10）

表1 各组大鼠体重变化（g，，n = 10）Tab.1 Changes of bodyweights of mice rats in various groups（g，，n = 10）

组别 性别 给药前给药后时间（d）14 21 28试验疫苗组 雄 225.0 ± 6.3 235.0 ± 7.5 250.7 ± 9.1 283.0 ± 11.9 332.9 ± 17.7 360.2 ± 34.1 402.5 ± 29.6雌 192.6 ± 6.6 194.7 ± 5.9 204.9 ± 5.8 221.7 ± 7.2 239.2 ± 8.1 253.2 ± 16.4 264.0 ± 17.2市售疫苗组 雄 223.6 ± 8.3 233.9 ± 10.0 250.4 ± 11.7 285.6 ± 14.3 337.4 ± 23.5 380.5 ± 28.5 414.4 ± 36.5雌 195.4 ± 5.8 201.2 ± 6.1 208.4 ± 6.7 223.1 ± 6.8 238.4 ± 16.4 256.3 ± 10.7 271.4 ± 13.0阴性对照组 雄 225.2 ± 8.9 233.9 ± 9.4 253.1 ± 10.2 281.3 ± 9.3 337.5 ± 15.0 377.1 ± 19.9 409.3 ± 23.7雌 194.6 ± 5.6 199.6 ± 8.8 206.3 ± 8.7 224.6 ± 10.4 235.3 ± 16.9 267.6 ± 22.5 278.1 ± 27.5 1 3 7

2.2.2 大体剖检 各组大鼠毛顺、有光泽，营养状况良好。颅腔内未见积水，脑膜未见出血，脑实质未见水肿；胸、腹膜光滑，未见黏连；胸、腹腔内未见积液；心、肺、脑、肝、肾、脾、胸腺、肾上腺、甲状腺、胰腺、性腺、胃肠道、淋巴结等形态、颜色、位置正常，未见肉眼可见的病理改变。

2.3 刺激性试验

2.3.1 体重 各组家兔的体重增长范围正常，差异均无统计学意义（t = 0.721 ~ 2.086，P 均 ＞ 0.05），见表2。表明药物对家兔体重无影响，且各组家兔均未发现全身毒性反应。

表2 各组家兔的体重变化（g）Tab.2 Changes of bodyweights of rabbits in various groups（g）

2.3.2 皮肤刺激反应评分 整个试验过程中，家兔注射部位皮肤肉眼观察未见充血、红肿等刺激反应，各检测时间点皮肤刺激反应评分结果（红斑 ／ 水肿）均为0。

2.3.3 解剖及组织病理学检查 各组家兔给药后4和23 d，注射部位皮肤及周围组织均未见注射部位皮下组织的刺激反应（如充血、坏死等），评分均为0。镜下检查显示，给药后4 和23 d，各组家兔的皮肤、皮下及肌肉各层结构清晰，形态正常，间质未见异常，见图1 ～ 图3。

图1 试验疫苗组家兔注射部位皮下组织病理切片的镜下观察（HE 染色，× 40）Fig.1 Microscopy of pathological section of subcutaneous tissue in injection site of rabbits immunized with test vaccine（HE staining，× 40）

图2 市售疫苗组家兔注射部位皮下组织病理切片的镜下观察（HE 染色，× 40）Fig.2 Microscopy of pathological section of subcutaneous tissue in injection site of rabbits immunized with commercial vaccine（HE staining，× 40）

图3 阴性对照组家兔注射部位皮下组织病理切片的镜下观察（HE 染色，× 40）Fig.3 Microscopy of pathological section of subcutaneous tissue in injection site of rabbits in negative control group（HE staining，× 40）

3 讨 论

2008年，甲型肝炎疫苗被列入国家计划免疫，甲肝减毒活疫苗因其价格低廉、免疫效果好及1 针接种的优势［15］，被列入国家采购计划。同时，随着国家对疫苗管理标准的不断提高，改进生产工艺、提升产品质量、提高市场竞争力已成为生产企业的重要需求。

减小疫苗成品规格是未来疫苗的发展趋势，也是疫苗质量提升的关键。在确保疫苗有效性和安全性不变的前提下，将甲肝减毒活疫苗的规格由复溶后1.0 mL ／ 剂变更为复溶后 0.5 mL ／ 剂，其主要优势在于能够减轻婴幼儿接种时的疼痛感，有利于计划免疫的推广和应用。本实验结果表明，3 批新规格的甲肝减毒活疫苗（复溶后0.5 mL ／ 剂）试验疫苗和市售甲肝减毒活疫苗（复溶后1.0 mL ／ 剂）小鼠血清抗体阳转率均为100%，且两者抗体平均滴度差异无统计学意义（P ＞0.05），表明两者的免疫原性效果相当。刺激性试验结果表明，两种疫苗组均未见毒性反应，表明新规格的甲肝减毒活疫苗具有良好的免疫原性和安全性。本研究为新规格甲肝减毒活疫苗的进一步应用提供了实验依据。