PEG3000 修饰的脂质体流感疫苗冻干粉稳定性及安全性

刘晓琳，李漂，张茜，杨艾，鲁卫东

昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室，云南 昆明 650500

疫苗水针剂需在冷链中分发及存储［1］，运输成本大，物流复杂，易引起疫苗变质等问题。普通脂质体的磷脂成分融合、聚集会导致包封药物的渗漏和脂质体的溶解［2-3］，而PEG 分子较高的柔顺性可形成致密的构象云，有效地覆在膜表面，阻止脂质体相互融合聚集，使其修饰的脂质体在体内外稳定性良好，并能减弱血浆成分对其的破坏或识别及吸附作用，延长血液循环半衰期，提高靶向效率，增强药物疗效，降低毒副作用［4-6］。

本实验采用冻融冻干法制备PEG3000 修饰的脂质体流感疫苗冻干粉，并在物理稳定性、生物稳定性、急性毒性、长期毒性方面进行稳定性及安全性考察。

1 材料与方法

1.1 流感疫苗原液 H1N1（SA201800，血凝素含量：225.0 μg ／ mL）、H3N2（SB2018002，血凝素含量：166.5 μg ／ mL）、B（V）（SC2018001，血凝素含量：369.1 μg ／ mL）、B（Y）（SC22018006，血凝素含量：326.1 μg ／ mL）均由江苏沃森生物技术公司提供。

1.2 实验动物 SPF 级昆明小鼠，5 周龄，体重18 ～22 g，雌雄各半，分笼饲养，由昆明医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（滇）2015-0002。本实验均以科研为目的对昆明种小鼠进行养殖和使用，且通过昆明医科大学实验伦理审查委员会的伦理审查。

1.3 主要试剂及仪器 大豆卵磷脂PC-50 购自北京美亚斯磷脂技术公司；胆固醇、Folin-酚蛋白定量试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术公司；相对分子质量 3 000 的 PEG 购自美国 Sigma 公司；RDE-Ⅱ购自日本生研株式会社；YP-TSD 型三箱式药品稳定性试验箱购自上海迈捷实验设备有限公司；XT-2001型全自动血细胞分析仪购自日本Sysmex 公司；LEICAEG1160 一体式石蜡包埋机、LEICARM2235 手动轮转式切片机和LEICADM4000B 光学显微镜购自德国徕卡仪器有限公司；PHY-Ⅲ病理组织漂烘仪购自常州市中威电子仪器有限公司等。

1.4 四价流感疫苗的配制 将4 个单价流感疫苗按比例稀释：H1N1 稀释 6.25 倍、H3N2 稀释 4.63 倍、B（V）稀释 10.25 倍、B（Y）稀释 9.06 倍，使每个单价流感疫苗的血凝素含量为36 μg ／ mL，然后将各单价流感疫苗混合形成36 μg ／ mL 的四价流感疫苗原液。

1.5 脂质体制备 采用冻融冻干法［7］。取胆固醇80 mg 和大豆卵磷脂300 mg 溶于无水乙醇，溶解后旋转蒸发至成膜状态后加入PBS 缓冲液（或含PEG-3000 的 PBS）30 mL，50 ℃水化旋转，间歇超声，50 ℃水浴孵育，取出冷却至常温；四价流感疫苗原液和脂质体混悬液按1.4 ∶1 混合，形成流感疫苗脂质体混悬液，-40 ℃冻融 2 次，0.06 mbar，-52 ℃下冷冻干燥28 h 即得中性脂质体流感疫苗（或PEG3000 修饰的脂质体流感疫苗）冻干粉。其中空白脂质体不含疫苗原液。

1.6 稳定性试验

1.6.1 物理稳定性 将PEG3000 修饰的脂质体流感疫苗混悬液、冻干粉分别储存于 4、（25 ± 2）、（37 ±2）℃［8］条件下，于第 0、1、2、6月取样，4 ℃，42 500 × g离心 1 h。Lowry 法检测包封率［9］。

1.6.2 生物稳定性 将PEG3000 修饰的脂质体流感疫苗冻干粉分别储存于4、（25 ± 2）℃条件下，原液始终储存于4 ℃。于第1、2、3月取样，腹腔免疫（6 μg 血凝素）小鼠，7 d 后经小鼠眼球采血，分离血清。微量血凝抑制法检测免疫后与免疫前抗体滴度比［10］，评价其生物稳定性。

1.7 安全性试验

1.7.1 急性毒性试验

1.7.1.1 分组及给药 取小鼠80 只，雌雄各半（雌雄小鼠分别观察），随机分为PEG3000 修饰的脂质体流感疫苗冻干粉组（PEG 组）、原液组、脂质体组（佐剂组）、PBS 组（阴性对照组），每组 20 只。PBS 复溶冻干粉。给药前称重，PEG 组和原液组小鼠每只腹腔给予最大剂量0.325 mL（15 μg 血凝素，2.5倍正常用量）［11］，佐剂组和阴性对照组小鼠每只腹腔给予同体积空白脂质体和PBS。

1.7.1.2 一般临床观察 给药前、给药4 h 内观察小鼠行为活动、外观体征（外观、对刺激的反应、分泌物、排泄物等）以及中毒反应症状和程度等，随后连续14 d 观察其一般状态及动物体重变化。

1.7.2 长期毒性试验

1.7.2.1 分组及给药 分组同1.7.1.1 项。给药前称重，分别在第 0、14 和 28 天分 3 次腹腔给药（6 μg血凝素）。

1.7.2.2 一般临床观察 给药前观察1 次，给药后持续观察1 h，其余每天上下午各观察1 次，恢复期每天观察1 次。观察项目同1.7.1.2 项。

1.7.2.3 体重及摄食量变化 每周称重1 次，计算各组小鼠平均体重，观察体重变化情况；每周称各笼剩余粮食1 次，计算每周平均摄食量。

1.7.2.4 血液学指标检测 末次接种后和恢复期结束后经小鼠眼球采血，全自动血细胞分析仪检测血常规，血液学指标正常值参考文献［12］。

1.7.2.5 组织解剖及病理学检查 恢复期结束后，称重，处死小鼠，剖检后，肉眼观察各脏器、器官组织是否异常；称取脏器重量，计算脏器系数；将组织置10%甲醛溶液固定，经切片、HE 染色后，镜检。

1.8 统计学分析 应用SPSS 17.0 软件进行统计学分析。采用双尾分析，检验水准设为0.05，统计结果以均值 ± 标准差（）表示［13］。以 P ＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 物理稳定性 PEG3000 修饰的脂质体流感疫苗冻干粉包封率明显高于混悬液，（37 ± 2）℃下放置6 个月，混悬液包封率急剧下降，而冻干粉包封率缓慢下降，表明冻干粉稳定性较好。见表1。

表1 PEG3000 修饰的脂质体流感疫苗包封率（%）Tab.1 Encapsulation efficiency of PEG3000 modified liposome influenza vaccine（%）

2.2 生物稳定性 PEG3000 修饰的脂质体流感疫苗冻干粉免疫后与免疫前抗体滴度比明显高于中性脂质体，低于疫苗原液，表明冻干粉在（25 ± 2）℃条件下保存3 个月，生物稳定性较好。见表2。

表2 PEG3000 修饰的脂质体流感疫苗冻干粉免疫后与免疫前抗体滴度比Tab.2 Antibody titer ratio of PEG3000 modified liposome influenza vaccine in a form of freeze-dried powder after and before immunization

2.3 急性毒性试验 试验期间小鼠精神状态良好，行为活动、外观体征均无异常，体重增加正常，未出现明显的与疫苗相关的异常症状。

2.4 长期毒性试验

2.4.1 一般临床观察 观察期内各组小鼠全部存活，行为活动、外观体征和注射部位均无异常现象，一般状况良好。

2.4.2 体重及摄食量 体重均呈增长状态，PEG 组、佐剂组、原液组与同期阴性对照组比较，差异无统计学意义（t = 3.12，P ＞ 0.05），见图 1。试验期间，各组小鼠摄食量未见与给药相关的明显异常。

图1 雌性（A）和雄性（B）小鼠长期毒性体重的变化Fig.1 Changes of bodyweights of female（A）and male（B）mice in long-term toxicity test

2.4.3 血常规 与同期同性别阴性对照组比较，原液组雌性小鼠末次接种后血小板数较恢复期明显升高，差异有统计学意义（t = 4.88，P ＜ 0.05），原液组和PEG 组雌性小鼠末次接种后白细胞数均较恢复期降低，差异均有统计学意义（t = 3.24，P ＜ 0.05）。各组间检测指标均有一定波动，但均在正常范围内变化，且变化幅度未见明显异常，表明PEG 修饰的脂质体流感疫苗冻干粉对小鼠机体血常规指标无不良影响。见表3。

表3 小鼠血液学指标检测结果（，n = 5）Tab.3 Test results of hematological indexes of mice（，n = 5）

表3 小鼠血液学指标检测结果（，n = 5）Tab.3 Test results of hematological indexes of mice（，n = 5）

检测时间 指标 性别 PEG 组 佐剂组 原液组 阴性对照组末次给药 血红蛋白含量（g ／ L） 雌 156.67 ± 0.94 154.60 ± 3.77 159.00 ± 5.76 152 3 d 后 雄 140.33 ± 27.13 172.80 ± 6.43 163.20 ± 2.79 168血小板数（× 109 个 ／ L） 雌 732.00 ± 111.63 633.80 ± 156.77 784.80 ± 171.88 488雄 673.67 ± 166.79 619.40 ± 183.60 816.60 ± 293.27 743白细胞（× 109 个 ／ L） 雌 2.27 ± 0.46 3.64 ± 0.43 2.74 ± 0.98 5.5雄 3.53 ± 1.38 3.40 ± 0.75 4.80 ± 0.30 2.2淋巴细胞绝对值（× 109 个 ／ L） 雌 2.07 ± 0.39 2.86 ± 0.32 2.36 ± 0.82 4.3雄 2.67 ± 1.13 2.84 ± 0.65 3.98 ± 0.12 1.7恢复期 血红蛋白含量（g ／ L） 雌 161.33 ± 5.73 152.80 ± 7.22 150.40 ± 7.58 157.00 ± 6.04结束 雄 160.00 ± 1.63 162.80 ± 6.40 134.80 ± 13.54 157.60 ± 5.00血小板数（× 109 个 ／ L） 雌 615.67 ± 31.12 457.40 ± 58.18 519.40 ± 53.55 554.25 ± 107.00雄 555.67 ± 81.71 531.00 ± 56.89 597.20 ± 102.89 547.20 ± 76.34白细胞（× 109 个 ／ L） 雌 6.10 ± 0.45 4.74 ± 2.11 4.44 ± 1.58 1.80 ± 0.67雄 3.97 ± 1.16 2.78 ± 0.96 4.32 ± 0.56 2.96 ± 0.46淋巴细胞绝对值（× 109 个 ／ L） 雌 5.03 ± 0.37 3.98 ± 1.79 3.86 ± 1.27 1.50 ± 0.47雄 2.90 ± 1.08 2.14 ± 0.71 3.20 ± 0.25 2.54 ± 0.39

2.4.4 脏器系数及病理性学观察 与同期同性别阴性对照组比较，原液组和PEG 组小鼠脾脏指数差异均有统计学意义（t = 1.89，P ＜ 0.05），且原液组大于PEG 组，PEG 组、原液组释放血凝素刺激机体产生免疫反应，机体淋巴系统活跃，使脾脏增大。各组小鼠其余脏器重量及脏器系数间差异无统计学意义（t = 0.67，P ＞0.05）。见表4。各实验组末次给药3 d 后及恢复期结束后，各组织均未见与给药相关的病理学改变，见图2（以部分组织为代表）。

图2 组织病理学观察（HE 染色，× 200）Fig.2 Histopathological observation（HE staining，× 200）

表4 小鼠脏器系数（，n = 5）Tab.4 Organ coefficients of mice（，n = 5）

表4 小鼠脏器系数（，n = 5）Tab.4 Organ coefficients of mice（，n = 5）

检测时间 脏器 性别 PEG 组 佐剂组 原液组 阴性对照组末次给药3 d 后 心 雌 0.55 ± 0.07 0.57 ± 0.05 0.50 ± 0.03 0.54 ± 0.08雄0.57 ± 0.08 0.55 ± 0.04 0.52 ± 0.04 0.55 ± 0.03脾脏 雌 0.33 ± 0.06 0.33 ± 0.08 0.43 ± 0.12 0.29 ± 0.04雄0.29 ± 0.04 0.23 ± 0.03 0.32 ± 0.08 0.22 ± 0.02肺脏 雌 0.92 ± 0.37 0.99 ± 0.22 0.90 ± 0.29 0.37 ± 0.05雄0.98 ± 0.30 0.77 ± 0.27 0.69 ± 0.16 0.31 ± 0.07胸腺 雌 0.55 ± 0.07 0.35 ± 0.09 0.37 ± 0.05 0.35 ± 0.05雄0.22 ± 0.05 0.25 ± 0.07 0.31 ± 0.07 0.23 ± 0.09脑雌1.45 ± 0.15 1.34 ± 0.06 1.32 ± 0.08 1.46 ± 0.04雄1.04 ± 0.05 1.20 ± 0.07 1.19 ± 0.11 1.19 ± 0.06恢复期结束 心 雌 0.47 ± 0.02 0.51 ± 0.03 0.52 ± 0.04 0.57 ± 0.02雄0.50 ± 0.03 0.49 ± 0.03 0.50 ± 0.04 0.52 ± 0.02脾脏 雌 0.30 ± 0.07 0.27 ± 0.06 0.35 ± 0.04 0.36 ± 0.11雄0.33 ± 0.15 0.23 ± 0.06 0.55 ± 0.21 0.23 ± 0.03肺脏 雌 0.62 ± 0.04 0.70 ± 0.06 0.74 ± 0.16 0.63 ± 0.05雄0.61 ± 0.07 0.72 ± 0.24 0.67 ± 0.16 0.61 ± 0.08胸腺 雌 0.34 ± 0.04 0.37 ± 0.06 0.45 ± 0.13 0.33 ± 0.07雄0.15 ± 0.04 0.23 ± 0.13 0.15 ± 0.06 0.23 ± 0.05脑雌1.27 ± 0.06 1.33 ± 0.08 1.34 ± 0.10 1.41 ± 0.07雄1.09 ± 0.03 1.07 ± 0.06 1.08 ± 0.10 1.07 ± 0.05

3 讨 论

本实验结果表明，在相同储存条件下，PEG3000修饰的脂质体流感疫苗冻干粉包封率明显高于混悬液，且在（25 ± 2）℃条件下储存 3 个月，仍能产生良好的体液免疫效应，表明冻干粉具有良好的稳定性，可缓解冷链运输压力，降低成本。

本实验通过急性毒性试验和重复多次给药的长期毒性试验，评估了临床试验可能发生的不良反应。结果显示，急性毒性试验条件下，腹腔免疫小鼠，注射部位均未出现肉眼可见的刺激性反应和异常病理改变。长期毒性试验期间，各实验组临床观察均未见与药物相关的异常反应；小鼠体重、摄食量均未见与给药相关的规律性改变；组织病理学检查未发现病变；血液学检测结果显示，疫苗制品在小鼠体内引起了较强的免疫反应，刺激机体造血系统，导致造血功能增强。根据白细胞数值来看，机体产生了一定的炎症反应，但均在正常范围内波动，表明炎症反应较轻。由于小鼠的性别差异和代谢特征会影响免疫系统功能，从而诱发雌、雄小鼠产生不同的免疫应答。雌性小鼠可产生雌激素刺激B 淋巴细胞增殖和抗体产生，免疫应答更强烈。血常规指标有一定波动，但均在正常值范围内，表明脂质体制剂对于小鼠血常规指标无不良影响。综上所述，PEG3000 修饰的脂质体流感疫苗冻干粉急性毒性和长期毒性试验均未见明显毒性反应，初步证实该疫苗具有良好的安全性。