鼻黏膜给药装置中5 种抗氧剂提取方法的建立及其在鼻喷流感减毒活疫苗中的迁移

修华谦，邵宏秋，李景新，张全顺，李吉，李晶晶，邹鑫，施歌，张凤吉，付沛林，石亮

1.吉林农业大学生命科学学院，吉林 长春 130118；2.长春百克生物科技股份公司，吉林 长春 130000；3.吉林省药品监督管理局长春检查分局，吉林 长春 130000；4.沈阳唯隆旺医药科技有限公司，辽宁 沈阳 110000

随着药品包材、药用辅料与药品关联审评政策的逐步实施，对药品包材变更进行相容性研究和评估显得尤为重要。《药品管理法》中明确指出，直接接触药品的包装材料和容器，应符合药用要求及保障人体健康、安全的标准［1］。药品包装应满足药品预期目的的适用性要求。适用性包括保护性、功能性、安全性和相容性［2］。药品与其直接接触的包装系统满足相容性要求，是保证药品质量安全必须具备的条件之一。相容性研究是证明包装材料与药品之间未发生严重的相互作用，并导致药品有效性和稳定性发生改变，或产生安全性风险的过程，研究内容包括包装材料或组件的可提取研究、药品与包装系统接触的浸出研究及可能产生的对药品和辅料活性成分的吸附研究［3-4］。

药品包装对于保证药物稳定性起着重要作用，因此将直接影响药品使用的安全性。目前市售疫苗直接接触的包材主要有西林瓶、胶塞、预灌封注射器，材质主要为玻璃和弹性体密封件，其中胶塞（即弹性体密封件）的配方中含有多种添加剂，如抗氧剂，工艺加工过程中的抗氧剂可能会不同程度地向药品中迁移，且添加剂及其降解物有一定毒性，均造成了包材的安全隐患［5］。

鼻黏膜给药装置（胶塞、鼻喷装置）各组件成分信息较复杂，为防止有毒有害物质向鼻喷流感减毒活疫苗中迁移，也为确保药品上市后的安全性和有效性等，必须对二者开展相容性研。本文旨在研究鼻黏膜给药装置胶塞和鼻喷装置中5 种抗氧剂的提取及其在鼻喷流感减毒活疫苗中的迁移，以分析疫苗与鼻黏膜给药装置之间的相容性［6］。

1 材料与方法

1.1 样品 鼻黏膜给药装置用氯化丁基橡胶胶塞（批号：0182469）和鼻喷装置（批号：0206925）购自美国BD 公司；鼻喷流感减毒活疫苗（批号：CP20210-404、CP20210405、CP20210406，规格：0.2 mL ／ 支）为长春百克生物科技股份公司产品；对照品抗氧剂3114（批号：A2115328）、330（批号：H2006214）、1076（批号：K2003215）、168（批号：J1816129）购自阿拉丁试剂上海有限公司；抗氧剂1010（批号：C190Q90）购自北京百灵威科技有限公司。

1.2 主要试剂及仪器 乙腈（批号：T0031440，色谱纯）和甲醇（批号：I3151440，色谱纯）购自德国CNW公司；四氢呋喃（批号：2021012601，色谱纯）购自山东省禹王实业总公司化学试剂厂；无水乙醇（批号：R142130）购自北京迪科马科技有限公司；AUW 120 D 电子分析天平购自日本岛津公司；MD 20 Hmini微波消解 ／ 萃取仪购自成都奥普乐仪器有限公司；Agilent 1200 高效液相色谱仪和色谱柱ZORBAX SB-C18（4.6 mm × 150 mm，5 μm）购自美国安捷伦科技公司；固相萃取柱购自Welchrom月旭科技（上海）股份有限公司。

1.3 溶液的配制

1.3.1 对照品溶液

1.3.1.1 3114 对照品 精密称定抗氧剂3114 对照品60 mg，置10 mL 量瓶中，加甲苯5 mL 使溶解，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为抗氧剂3114 对照品贮备液；量取0.5 mL，置25 mL 量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为抗氧剂3114 对照品母液；量取对照品母液1 mL，置10 mL 量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为抗氧剂3114 对照品溶液［7］。

1.3.1.2 1010 对照品 精密称定抗氧剂1010 对照品45 mg，按照抗氧剂3114 步骤制备对照品贮备液；量取1 mL，按照抗氧剂3114 步骤制备对照品母液和溶液。

1.3.1.3 330 对照品 精密称定抗氧剂330 对照品30 mg，按照对照品1010 步骤制备对照品贮备液、母液和溶液。

1.3.1.4 1076 对照品 精密称定抗氧剂1076 对照品60 mg，按照抗氧剂3114 步骤制备对照品贮备液；量取2 mL，按照抗氧剂3114 步骤制备对照品母液和溶液。

1.3.1.5 168 对照品 精密称定抗氧剂168 对照品60 mg，按照抗氧剂3114 步骤制备对照品贮备液；量取2.5 mL，按照抗氧剂3114 步骤制备对照品母液和溶液。

1.3.1.6 混合对照品 分别精密量取抗氧剂3114、1010、330、1076、168 对照品母液各 1 mL，置 10 mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即5 种抗氧剂混合对照品溶液。

1.3.1.7 检测限及定量限溶液 精密量取5 种抗氧剂混合对照品溶液1 mL，置25 mL 量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为5 种抗氧剂灵敏度贮备液，量取2 mL，置10 mL 量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为5 种抗氧剂定量限溶液。精密量取5 种抗氧剂灵敏度贮备液1 mL，置10 mL 量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为5 种抗氧剂检测限溶液。

1.3.1.8 线性溶液 分别精密量取抗氧剂3114、1010、1076 对照品贮备液 0.5、1、2 mL，置 25 mL 量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为线性母液。分别量取线性母液 0.2、0.5、1、2、3、4 mL 至 10 mL 量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，分别作为线性溶液。

1.3.2 供试品溶液

1.3.2.1 供试品溶液1 取剪碎的胶塞约2 g，精密称定，置微波萃取罐中，加入甲苯-甲醇（2 ∶3）溶液10 mL，加盖密封，置微波消解仪内100 ℃微波萃取30 min，冷却后，萃取液经 0.22 μm 滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液 1［8］。

1.3.2.2 供试品溶液2 取鼻喷流感减毒活疫苗，精密量取1 mL，用固相萃取柱萃取（萃取柱临用前分别用甲醇4 mL 及水4 mL 活化），用50%乙醇溶液进行洗脱，定容至10 mL，经0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液2。

1.3.2.3 供试品溶液3 取剪碎的胶塞3 份各约2 g，精密称定，置微波萃取罐中，分别加入线性母液0.8、1、1.2 mL，再分别加入甲苯 ∶甲醇（2 ∶3）溶液9.2、9、8.8 mL，加盖密封，置微波消解仪内 100 ℃微波萃取30 min，冷却后，萃取液经0.22 μm 滤膜滤过，取续滤液，分别作为80%供试品溶液3、100%供试品溶液3、120%供试品溶液3。每个浓度平行制备3 份。

1.3.2.4 供试品溶液4 精密量取鼻喷流感减毒活疫苗3 份各1 mL，分别加入线性母液0.8、1、1.2 mL，用固相萃取柱萃取，用50%乙醇溶液进行洗脱，定容至 10 mL，经 0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，分别作为 80%供试品溶液 4、100%供试品溶液4、120%供试品溶液4。每个浓度平行制备3 份。

1.3.2.5 供试品溶液5 取剪碎的胶塞约2 g，精密称定，置微波萃取罐中，加入3 种抗氧剂检测限贮备液 1 mL，再加入甲苯：甲醇（2 ∶3）溶液至 10 mL，置微波消解仪内100 ℃微波萃取30 min，冷却至室温，经0.22 μm 微孔滤膜滤过，作为胶塞加标溶液。

1.3.2.6 供试品溶液6 取鼻喷流感减毒活疫苗，精密量取1 mL，加入2 种抗氧剂检测限贮备液1 mL，用固相萃取柱萃取（萃取柱临用前分别用甲醇4 mL及水4 mL 活化），用50%乙醇溶液进行洗脱，定容至10 mL，经0.22 μm 微孔滤膜过滤，作为鼻喷流感减毒活疫苗加标溶液。

1.3.2.7 供试品溶液7 取剪碎的鼻喷装置约2 g，精密称定，置微波萃取罐中，精密加入甲苯-甲醇（2 ∶3）溶液10 mL，加盖密封，置微波消解仪内100 ℃微波萃取30 min，冷却后，萃取液经0.22 μm 滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液7。

1.3.2.8 供试品溶液8 取鼻喷流感减毒活疫苗若干支，置电热恒温鼓风干燥箱中，40 ℃放置48 h，冷却后，精密量取1 mL，用固相萃取柱萃取，用50%乙醇溶液进行洗脱，定容至10 mL，经0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，作为鼻喷流感减毒活疫苗模拟提取溶液。

1.4 胶塞、鼻喷装置中抗氧剂的提取 考虑药液的pH值、离子强度、极性等因素，以及胶塞、鼻喷装置的配方，根据添加剂与溶剂极性相似相溶的原理，选择药液本身以及有机溶剂，并采取加热回流和微波萃取的方式，对胶塞、鼻喷装置中的抗氧剂（3114、1010、330、1076、168）进行提取，采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）考察 5 种抗氧剂在胶塞、鼻喷装置中的含量［6］，色谱条件：使用 ZORBAX SB-C18（4.6 mm × 150 mm，5 μm）色谱柱，流动相：乙腈-四氢呋喃（6 ∶3）-水（9 ∶1），柱温：40 ℃，波长：280 nm，流速：1.5 mL / min，进样量：10 μL［8］。

1.5 胶塞、鼻喷装置中抗氧剂的迁移试验 考察3批鼻喷流感减毒活疫苗在加速［（25 ± 2）℃放置0、5、10 d］和长期稳定性（2 ～ 8 ℃放置 3、6 个月）试验条件下，鼻黏膜给药装置胶塞、鼻喷装置中的5 种抗氧剂（3114、1010、330、1076、168）迁移进入鼻喷流感减毒活疫苗中的情况［9］。

1.6 安全性评估 根据提取试验可提取物5 种抗氧剂的含量是否低于其分析评价阈值（analysis and evaluation threshold，AET），评价可提取物的安全风险，通过每日药品最大摄入量（0.2 mL），计算有害成分的最大摄入量，并与有害成分的人每日允许摄入量（permitted daily exposure，PDE）进行比较，评价其安全性［10-12］。根据胶塞、护帽中可提取物迁移试验结果，由添加剂的未观测到效应水平（no observed effect level，NOEL）值计算其 PDE 值，评估鼻喷流感减毒活疫苗与鼻黏膜给药装置直接接触的安全性［13-16］。

1.7 方法的验证

1.7.1 专属性 取空白溶剂、样品溶液、对照品溶液，通过HPLC 测定分析，记录色谱图。研究各目标物的色谱峰是否受空白溶剂、包材、药液基质的干扰，记录各目标峰的保留时间［17］。

1.7.2 检测限和定量限 取检测限及定量限溶液，通过HPLC 测定分析，以3 倍信噪比峰强度所对应对照品溶液的浓度为检测限；以10 倍信噪比峰强度所对应对照品溶液的浓度为定量限。

1.7.3 线性与范围 分别取6 个浓度的抗氧剂3114、1010、1076 线性溶液，通过 HPLC 测定分析，记录相应的峰面积，以线性溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性方程，并计算相关系数（r），r 应 ≥ 0.999［18］。

1.7.4 重复性 参考供试品溶液的配制方法，平行配制6 份，通过HPLC 测定分析，并计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。5 种抗氧剂检测结果的RSD 应≤4%。

1.7.5 准确性 各平行配制3 种加标浓度的供试品溶液，同一浓度平行制备3 份，同时制备3 份未加混合标准母液的空白溶液，通过HPLC 测试分析，并计算5 种抗氧剂的回收率［19］。回收率应在85% ~110%范围内。

2 结 果

2.1 胶塞、鼻喷装置中抗氧剂的含量 提取试验结果表明，胶塞中检出抗氧剂3114 和1076，未检出其他3 种抗氧剂；鼻喷装置中检出抗氧剂3114、1010和1076，未检出其他2 种抗氧剂。符合《欧洲药典》对5 种抗氧剂的限度要求。见表1、图1 ～图3。

表1 胶塞、鼻喷装置中 5 种抗氧剂含量（μg ／ g）Tab.1 Contents of five kinds of antioxidants in rubber stoppers and nasal mucosal drug delivery device（μg ／ g）

图1 5 种抗氧剂混合对照品图谱Fig.1 Mixed reference substance map of five kinds of antioxidants

图2 胶塞中抗氧剂3114（左峰）和1076（右峰）图谱Fig.2 Spectrum of antioxidants 3114（left peak）and 1076（right peak）in rubber stoppers

图3 鼻喷装置中抗氧剂3114（左峰）、1010（中峰）和1076（右峰）图谱Fig.3 Spectrum of antioxidants 3114（left peak），1010（middle peak）and 1076 （right peak）in nasal mucosal drug delivery device

2.2 胶塞、鼻喷装置中抗氧剂的迁移 3 批鼻喷流感减毒活疫苗在加速和长期稳定性试验条件下，均未检出5 种抗氧剂，见图4。

图4 迁移试验中5 种抗氧剂检测的高效液相色谱图Fig.4 HPLC profile of five antioxidants in migration test

2.3 安全性评估 根据提取试验和迁移试验结果可知，药液中不含5 种抗氧剂或测定结果低于仪器的检测限，从材料的安全角度出发，药品中可能含有的抗氧剂以仪器的检测限计，即抗氧剂3114、1010、330、1076、168 的检测限分别为 0.047 8、0.070 6、0.047 8、0.188 4 和 0.235 6 μg ／ mL。5 种抗氧剂的日最大摄入量均小于各PDE，且仪器的检测限浓度小于AET，方法灵敏度满足AET 的测定要求，对患者的安全性风险较小。见表2。

表2 5 种抗氧剂含量Tab.2 Contents of five kinds of antioxidants

2.4 方法的验证

2.4.1 专属性 试验结果显示，空白溶剂与其他成分对5 种抗氧剂检测无干扰，表明方法专属性良好。

2.4.2 检测限和定量限 抗氧剂3114、1010、330、1076、168 的检测限分别为 0.047 8、0.070 6、0.047 8、0.188 4、0.235 6 μg ／ mL；定量限分别为 0.095 6、0.141 2、0.095 6、0.376 9、0.471 3 μg ／ mL。

2.4.3 线性与范围 抗氧剂3114 在浓度2.390 3 ～47.805 4 μg ／ mL 范围内，线性关系良好，线性方程为 y = 1.673 6 x + 0.229 6（r = 0.999 9）；抗氧剂1010 在浓度 3.529 6 ～ 70.591 4 μg ／ mL 范围内，线性关系良好，线性方程为y = 2.166 4 x + 0.286 3（r = 0.999 9）；抗氧剂 1076 在浓度 9.422 5 ～188.449 3 μg ／ mL 范围内，线性关系良好，线性方程为 y = 1.264 6 x + 0.431 4（r = 0.999 9）。见图 5。

图5 抗氧剂 3114（A）、1010（B）、1076（C）含量测定线性关系图Fig.5 Linear relationship diagram for determination of contents of antioxidants 3114（A），1010（B）and 1076（C）

2.4.4 重复性 鼻喷流感减毒活疫苗中未检出抗氧剂3114、1010 和 1076；胶塞中检出抗氧剂 3114和1076，其含量检测结果的RSD 分别为0.9%和1.0%，未检出抗氧剂1010。表明该方法重复性良好。见表3。

表3 胶塞中抗氧剂 3114 和 1076 含量重复检测结果（μg ／ g）Tab.3 Repeat test results of contents of antioxidants 3114 and 1076 in rubber stoppers（μg ／ g）

2.4.5 准确性 胶塞中抗氧剂 3114、1010、1076 的平均回收率分别为100.5%、98.7%和96.6%；鼻喷流感减毒活疫苗中抗氧剂3114、1010、1076 的平均回收率分别为95.5%、95.7%和97.0%。表明该方法准确性较高。

3 讨 论

本研究建立了5 种抗氧剂的提取方法，采用HPLC法可精准检测5 种抗氧剂在鼻黏膜给药装置胶塞和鼻喷装置中的含量，以及在鼻喷流感减毒活疫苗中的迁移量。通过专属性、检测限、定量限、线性、重复性、准确性验证，表明通过此方法可获得准确、可靠的5 种抗氧剂含量，为抗氧剂迁移入药品的安全性评估提供了依据。同时，此方法简单方便，可为此类包材相容性研究提供一种有效、准确的检测方法，可用于迁移试验中抗氧剂的含量测定。

本研究发现，胶塞中检出抗氧剂3114 和1076，未检出其他3 种抗氧剂，鼻喷装置中检出抗氧剂3114、1010 和 1076，未检出其他 2 种抗氧剂，符合《欧洲药典》对5 种抗氧剂的限度要求。鼻喷流感减毒活疫苗在加速0、3、6 个月，长期6 个月稳定性试验条件下，均未检出5 种抗氧剂。通过5 种抗氧剂的提取和迁移试验研究，表明鼻喷流感减毒活疫苗与鼻黏膜给药装置相容性良好。