金黄色葡萄球菌四组分候选疫苗的免疫原性和保护效力评价

郭京蓉，林海涛，周继唯，肖盟，袁玉兰，张云涛

1.国药中生生物技术研究院有限公司，北京 101111；2.中国医学科学院北京协和医院检验科，北京 100730；3.中国生物技术股份有限公司，北京 100029

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，简称金葡菌）是重要的院内感染病原菌之一，可导致心内膜炎、肺炎、脓毒性关节炎、骨髓炎和全身脓毒血症等多种严重疾病［1］。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）等多重耐药菌株的出现使抗生素治疗有效率降低，疾病反复发作难以治愈，住院时间延长，病死率增加［2］，医疗费用大幅上升，金葡菌感染已成为全球范围内主要的临床负担。

疫苗是感染性疾病重要的防控手段。基于前期对预防金葡菌候选疫苗研发失败原因的分析［3］，目前研发者普遍认为，针对表面多糖、细胞壁相关蛋白和分泌毒素等多靶点的多抗原组分疫苗诱导的保护性免疫反应可在金葡菌感染和致病过程中发挥叠加或协同效应，达到理想的保护效果。荚膜多糖（capsular polysaccharide，CP）具有抗吞噬作用，是金葡菌免疫逃避的关键。所有金葡菌临床分离株均有CP5 或CP8 的遗传途径（基因通路），大部分菌株可表达CP5 或CP8，将纯化CP 抗原与载体蛋白结合可提高其免疫原性和诱导T 细胞记忆［4］。α-溶血素（α-hemolysin，Hla）和锰转运蛋白 C（manganese transporter C，MntC）分别是金葡菌分泌毒素和表面蛋白，在临床分离株中广泛表达且高度保守。Hla 对多种血细胞和组织细胞具有破坏作用，导致炎症和组织损伤病变，能帮助金葡菌逃避宿主免疫攻击；MntC 是金葡菌在宿主体内获取锰元素维持生长代谢的关键蛋白，在抵抗宿主免疫防御中发挥作用。CP 结合物、重组蛋白突变无毒 Hla（mutant nontoxic Hla，mHla）和MntC 均已在动物模型中显示出一定的免疫原性和保护作用［5-7］，相关金葡菌多组分候选疫苗已进入临床研究阶段［8-9］。本研究用CP5 结合物、CP8 结合物、重组蛋白mHla、MntC 配制金葡菌四组分候选疫苗（Staphylococcus aureus 4-antigen vaccine，SA4Ag）免疫小鼠，采用不同基因型的金葡菌进行感染，以评价SA4Ag 的免疫原性和保护效力。

1 材料与方法

1.1 菌株 金葡菌国际标准株49521（CP5 型）和49525（CP8 型）购自ATCC，由国药中生生物技术研究院有限公司金葡课题组传代保存；6 株国内临床分离株分别分离自 75、66、5、72、74、69 岁金葡菌感染患者的血液样本，编码为WLMQ-1801、LZ-3211、NN-567、NN-591、SY-1490、HF-1588，前 3 份样本为cap8 基因型，后3 份为cap5 基因型，均由中国医学科学院北京协和医院检验科保存。

1.2 主要试剂及仪器 铝佐剂购自德国Brenntag公司；HRP 标记的羊抗鼠 IgG1、IgG2a、IgG2b 购自美国Jackson ImmunoResearch 公司；牛血清白蛋白（BSA）购自澳洲 BOVOGEN 公司；CP5 结合物、CP8 结合物、重组蛋白mHla、MntC 及胰蛋白酶大豆琼脂（tryptic soy agar，TSA）平板由国药中生生物技术研究院有限公司金葡课题组制备；酶标仪（MULTISKAN ASCENT）购自美国Thermo 公司。

1.3 实验动物 SPF 级 BALB ／c 小鼠，雌性，5 周龄，体重14 ~ 16 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号为：SCXK（京）2016-0006。本实验对小鼠的所有处理均以科研为目的进行养殖和使用，且按照《北京市实验动物伦理审查指南》相关规定进行。

1.4 疫苗的配制 采用CP5 结合物、CP8 结合物、重组蛋白mHla、MntC 配制SA4Ag，将各组分原液加入PBS 稀释的铝佐剂中，每剂SA4Ag（0.2 mL）中含 CP5、CP8 各 2.5 μg，mHla、MntC 各 5 μg，铝佐剂100 μg。

1.5 攻毒菌液的制备 将金葡菌国际标准株49521、49525 及6 株临床分离株接种至TSA 平板，于37 ℃培养24 h；刮取菌苔于PBS 中，用分光光度法测定浓度（A600），调节至所需浓度。

1.6 SA4Ag 免疫后小鼠血清中特异性抗体水平的检测将10 只小鼠随机分为免疫组和对照组，每组5 只，经皮下分别免疫SA4Ag 和铝佐剂，0.2 mL／只，共免疫3次，每次间隔2 周。末次免疫后10 d，经眼眶采血，分离血清，-20 ℃保存。用碳酸盐缓冲液稀释各抗原，分别包被酶标板（CP5 及 CP8 为 0.2 μg ／孔，mHla 及MntC 为 0.1 μg ／孔），4 ℃过夜；PBST 洗涤 3 次，用 1%BSA 于 37 ℃封闭 2 h；PBST 洗涤 3 次，加待测血清（2 倍系列稀释，1 ∶100~1 ∶6 553 600），37 ℃孵育 1 h；PBST 洗涤3 次，分别加入HRP 标记的羊抗鼠IgG1、IgG2a 和 IgG2b（均 1 ∶10 000 稀释），37 ℃孵育 30 min；PBST 洗涤 3 次，加入 TMB 显色液，37 ℃显色 10 min；2 mol／L 硫酸终止反应，用酶标仪检测A450。以对照组A450均值的2.1 倍为cut-off 值，免疫组血清A450≥cut-off 值的最高稀释度即为抗体滴度。

1.7 SA4Ag 免疫后小鼠血液及脏器中细菌载量的检测将48 只小鼠随机分为免疫组和对照组，每组24 只，分别免疫SA4Ag 和铝佐剂，免疫途径及剂量同1.6 项。末次免疫后10 d，经小鼠腹腔分别注射亚致死剂量的金葡菌国际标准株49521 和49525 菌液，剂量分别为3.5× 108和2.0× 109CFU ／（0.2 mL·只），各组每种菌液分别感染12 只。于感染后1 和3 d，经眼球摘除采血，至肝素采血管内；无菌取小鼠心脏和肾脏，充分研磨，用 PBS 进行 10 倍系列稀释（101~ 105）后，涂布于TSA 平板，37 ℃培养过夜，进行 CFU 计数［10］。

1.8 SA4Ag 免疫后小鼠脏器的组织病理学观察 将24 只小鼠随机分为免疫组和对照组，每组12 只，分别免疫SA4Ag 和铝佐剂，免疫途径及剂量同1.6 项。末次免疫后10 d，分别注射亚致死剂量的金葡菌国际标准株49521 和49525，感染途径及剂量同1.7 项，各组每种菌液分别感染6 只。感染后0 和3 d，观察小鼠生存状态，并称体重；感染后3 d，无菌取小鼠心脏和肾脏，经4%多聚甲醛溶液浸泡固定，参考文献［10］方法制备切片，进行镜下观察。

1.9 SA4Ag 免疫后小鼠生存率的计算 将160 只小鼠随机分为免疫组和对照组，每组80 只，分别免疫SA4Ag 和铝佐剂，免疫途径及剂量同1.6 项。末次免疫后10 d，经小鼠腹腔分别注射致死剂量的金葡菌国际标准株49521、49525 及6 株临床分离株 WLMQ-1801、LZ-3211、NN-567、NN-591、SY-1490、HF-1588 菌液，感染剂量分别为 7.0 × 108、4.0 × 109、7.0 × 109、5.0 × 109、4.0 × 109、9.0 × 109、1.0 × 1010、4.0×109CFU ／（0.2 mL·只）。感染后连续观察10 d，每日记录小鼠存活情况。

1.10 统计学分析 应用Prism 5 软件进行作图和统计学分析，试验数据以均值 ± 标准差（）表示，组间比较采用独立样本t 检验，生存曲线间的比较采用Mantel-Cox Log-rank 检验，以P < 0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 SA4Ag 免疫后小鼠血清中的特异性抗体水平SA4Ag 免疫后可诱导高水平的 CP5、CP8、mHla 和MntC 抗原特异性 IgG1、IgG2a 和 IgG2b 亚型抗体，抗体亚型以IgG1 为主，各抗原的特异性IgG1 水平均明显高于 IgG2a（t 分别为 10.190、9.254、5.774 和15.010，P 均 ＜ 0.001）。见图 1。

图1 小鼠血清中各亚型抗体水平Fig.1 Serum antibody levels of various subtypes in mice

2.2 SA4Ag 免疫后小鼠血液及脏器中的细菌载量与对照组比较，金葡菌国际标准株49521 和49525菌液感染1、3 d 后，免疫组小鼠血液、心脏、肾脏中的细菌载量均明显降低（t = 2.362 ~ 6.253，P =0.000 2 ~ 0.039 8），见图 2。表明 SA4Ag 免疫可通过抑制或杀灭细菌，降低细菌载量，保护小鼠抵抗金葡菌感染。

图2 各组小鼠血液及器官中的细菌载量Fig.2 Bacterial loads in blood and organs of mice in various groups

2.3 SA4Ag 免疫后小鼠脏器的组织病理学观察 金葡菌国际标准株49521 和49525 菌液感染3 d 后，对照组小鼠心脏均可见多灶性化脓性炎、心肌间隙炎及炎细胞浸润伴菌丝等明显病变，肾脏可见多灶性化脓性炎、小灶炎、集合管内菌斑及炎细胞浸润等明显病变；免疫组小鼠心脏、肾脏未见明显病理改变或病变较轻微。见图3。表明SA4Ag 免疫可通过抑制或杀灭细菌，降低细菌攻击器官组织的能力，减轻心脏、肾脏组织病理损伤和炎性细胞浸润。

图3 各组小鼠脏器组织病理学观察（HE 染色，× 200）Fig.3 Histopathological examination of organs of mice in various groups（HE staining，× 200）

2.4 SA4Ag 免疫后小鼠的生存状态及体重 金葡菌国际标准株49521 和49525 菌液感染后，对照组小鼠发病症状（精神萎靡、弓背耸毛等）明显，免疫组小鼠发病症状较轻，生存状态较好。与感染0 d 比较，金葡菌国际标准株49521 和49525 菌液感染3 d后，对照组小鼠体重均明显下降（t 分别为12.570 和9.595，P 均 ＜ 0.001），免疫组差异无统计学意义（t分别为 1.880 和 1.932，P 分别为 0.096 9 和 0.089 5）；感染0 d 时，金葡菌国际标准株49521 和49525 菌液的对照组与免疫组小鼠体重差异均无统计学意义（t 分别为 0.572 和 0.896，P 分别为 0.582 9 和 0.396 3），感染3 d 后，对照组小鼠体重均明显低于免疫组（t 分别为 4.608 和 2.966，P 分别为 0.001 7 和 0.018 0）。见图4。表明SA4Ag 免疫能减轻小鼠感染后发病症状，减少体重下降幅度，提高小鼠生存质量。

图4 各组小鼠的体重Fig.4 Bodyweights of mice in various groups

2.5 SA4Ag 免疫后小鼠的生存率 与对照组比较，感染金葡菌国际标准株49521、49525 及6 株临床分离株 WLMQ-1801、LZ-3211、NN-567、NN-591、SY-1490、HF-1588 菌液的免疫组小鼠生存率可提高70% ~90%，且差异均有统计学意义（χ2分别为 16.76、17.98、14.58、14.03、16.06、7.358、6.227、15.34，P 分别为 ＜ 0.000 1、＜ 0.000 1、0.000 1、0.000 2、＜ 0.000 1、0.006 7、0.012 6 和 ＜ 0.000 1），见图 5。表明SA4Ag在小鼠体内针对不同菌株致死剂量感染可提供广泛保护。

图5 各组小鼠的生存曲线Fig.5 Survival curves of mice in various groups

3 讨 论

金葡菌感染和耐药是全球性临床及公共卫生问题，2017年被 WHO 列入耐药细菌清单［11］，2014 —2019年，金葡菌检出率在我国临床分离的革兰阳性菌中居首位，MRSA 检出率达30%以上［12］，金葡菌致病因子较多，在研发多组分疫苗时需进行抗原的选择和组合，有效的疫苗抗原应为在人类感染过程中广泛表达且高度保守的毒力因子，能诱导产生直接抑制细菌活力及毒性的抗体或介导调理吞噬作用的抗体及诱导适当的细胞免疫反应，应在模拟人类疾病的临床前动物模型中具有保护性［13］。

若抗体能在感染早期阶段抑制并消灭细菌，阻止全面持续感染的发生，疫苗研发成功的几率更大，因此，识别和选择能诱导保护性免疫应答并在感染早期表达的抗原十分重要。CP 和MntC 均在感染早期表达，CP 的表达是金葡菌等致病菌逃避先天免疫反应的常见机制，有利于细菌在体内生存。纯化CP与载体蛋白结合后免疫原性提高，可诱导产生具有调理吞噬杀菌能力的功能抗体。Hla 是金葡菌表达的成孔外毒素，能裂解人的血小板、内皮细胞、上皮细胞和白细胞等多种细胞，还能裂解兔红细胞，但不裂解人的红细胞，因此可应用于体外溶血实验。Hla与靶细胞结合后，寡聚成孔前结构，随后通过脂质双分子层挤压桶攻击细胞膜，形成七聚体亲水性跨膜通道。Hla 是金葡菌具有充分致病力所必需的，Hla表达增加的菌株毒力更强［14］。Hla 通过裂解多种细胞，削弱宿主免疫系统，实现免疫逃逸和细菌播散，并导致炎症和多器官组织破坏，在肺炎、败血症等多种金葡菌感染性疾病发病机制中起关键作用［15］。锰与金葡菌增殖存活和毒力作用密切相关，其中锰主要作为超氧化物歧化酶的重要辅助因子，可确保超氧化物歧化酶的活性，从而抑制活性氧，抵御中性粒细胞的氧化杀伤。锰在金葡菌生命活动中必不可少，但过量存在对金葡菌又有毒性，因此锰的摄取受到高度调控。MntC 是负责锰获取（金属结合）的异三聚体膜转运蛋白MntABC 的表面暴露亚基，在富营养条件下的体外生长过程中不表达，但感染后在体内表达迅速上调，协助金葡菌摄取锰，从而抵御和修复氧化杀伤，使金葡菌在吞噬氧化暴发后在体内存活并高效生长，这是金葡菌在宿主体内传播和建立感染的关键［16-17］。另外，MntC 还可通过与细胞外基质和凝血级联宿主蛋白的相互作用，协助金葡菌黏膜定植和侵袭性感染［18］。本研究制备了包含针对上述4 个靶点抗原组分的SA4Ag，可通过抑制或阻断金葡菌毒素释放、生长代谢和免疫逃逸等关键致病环节，从而发挥更强的保护作用。

用适宜的动物模型进行体内保护效力实验是对疫苗最直接有效的评价方式。虽然动物实验在评价疫苗效力方面存在局限性，与应用于真实目标人群存在一定差异，但基于临床感染特点的动物模型仍是疫苗临床前研究不可或缺的评价方法，是进行临床研究的重要参考。本研究制备的SA4Ag 以氢氧化铝为佐剂，可诱导产生抗原特异性高效价的IgG 各亚型抗体。本实验结果表明，在亚致死剂量下，SA4Ag 免疫可明显降低小鼠血液和脏器细菌载量（P ＜0.05），减轻脏器病理改变，维持小鼠更好生存状态，明显减少体重下降幅度（P ＜ 0.05）；致死剂量下，SA4Ag 免疫可显著提高小鼠生存率（P ＜0.05），对不同菌株（标准菌株和临床分离菌株）产生广谱保护。用多个有代表性的流行菌株在动物模型中进行挑战实验是衡量疫苗效力的可靠方法［13］，本研究中多个具有代表性的国内临床分离株对免疫小鼠的攻毒保护性结果为证实SA4Ag 的保护效力提供了更全面的数据支持。

综上所述，SA4Ag 具有较好的免疫原性，在小鼠全身感染模型中可产生较好的保护效力。