纤维蛋白原国家标准品的研制

孙楠，于婷，张文新，孙晶，胡泽斌，高飞，曲守方，黄杰

中国食品药品检定研究院，北京 100050

纤维蛋白原（fibfinogen，Fib）即凝血因子Ⅰ，是血浆中含量最高的一种凝血蛋白，是凝血系统的核心蛋白质。Fib 在凝血过程最后阶段由凝血酶转化成纤维蛋白单体，最终形成不溶性纤维蛋白凝块，从而发挥血液凝固作用［1］。健康人血浆中Fib 含量的参考值为2.0 ~ 4.0 mg ／ mL，超过该范围时，表明凝血功能异常。Fib 水平增高（＞ 4 mg ／ mL）常见于糖尿病、急性传染病、肾病综合征、妊高症、心脑血管疾病、恶性肿瘤、炎症应激反应、肥胖症［2-5］；Fib 水平降低（＜ 2 mg ／ mL）常见于弥漫性血管内凝血（disseminated intravascular coagulation，DIC）、原发性纤溶症、重症肝炎、肝功能严重障碍或先天性缺乏［6-8］，低于 1.5 mg ／ mL 时，机体发生出血的概率明显增加［9］。

WHO 于1992年建立了第1 个血浆Fib 国际标准品［10］，编号：89 ／ 644，取值 2.4 mg ／ mL。该标准品得到普及和应用，但该标准品在复溶时有些浑浊，长期存放后尤为明显；WHO 于1999年建立了第 2 个血浆 Fib 国际标准品［11］，编号：98 ／ 612，取值2.2 mg ／安瓿，代替了第 1 个标准品；WHO 于 2014年建立了第 3 个血浆 Fib 国际标准品［12］，编号：09 ／264，取值2.7 mg ／ 安瓿。但国际标准物质购买周期长，且费用较高。目前，我国尚无人血浆Fib 标准物质。因此，本实验进行首批血浆Fib 国家标准品的研制，以期改善该标准物质匮乏的现状。

1 材料与方法

1.1 原料 血浆（枸橼酸钠抗凝）由北京赛科希德科技股份有限公司提供。

1.2 国际标准品 第3 批人血浆Fib 国际标准品（NIBSC 批号：09 ／ 264，取值 2.7 mg ／ 支）由中国食品药品检定研究院提供。

1.3 主要试剂 Fib 测定试剂盒（凝固法）分别由北京九强生物技术股份有限公司、希森美康生物科技（无锡）有限公司、广州万孚生物技术有限公司、北京赛科希德科技股份有限公司、沃芬医疗器械商贸（北京）有限公司及迈克生物股份有限公司提供；Fib 测定试剂盒（液体）由迈瑞集团长岛生物技术有限公司提供；Fib 测定试剂盒（散射比浊法）由西门子医学诊断产品（上海）有限公司提供；梅特勒卡尔费休水分滴定仪由北京利德曼生化股份有限公司提供；全自动凝血分析仪（型号：maccura H-04）由迈克生物股份有限公司提供；全自动凝血分析仪（型号：TECO Coatron 3000）由北京九强生物技术股份有限公司提供。

1.4 国家标准品的制备 用冷沉淀法从血浆中获得Fib 沉淀［13］，采用北京赛科希德科技股份有限公司的Fib 测定试剂盒（凝固法）测定沉淀和上清血浆中Fib 含量，将Fib 沉淀与Fib 含量较低的原料血浆混合，配制成 Fib 含量为 4、2、0.75 mg ／ mL 的定值血浆（水平Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）。按 0.5 mL ／ 安瓿进行分装，委托基蛋生物科技股份有限公司冻干和融封，即为Fib 国家标准品。

1.5 水分测定 随机抽取水平Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的Fib 国家标准品各 3 支，按《中国药典》三部（2020 版）［14］规定，采用库伦滴定法进行水分测定［15］，冻干品的残水量应＜5%。

1.6 均匀性检验 随机抽取水平Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的Fib 国家标准品各10 支，参照CNAS-GL03《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》［16］，采用maccura H-04型全自动凝血分析仪检测标准品的均匀性，每支重复检测2 次。对检测结果进行单因素方差分析，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。并以Fib 国际标准品为对照，对国家标准品与对照的效价比值（Pt）进行变异系数分析。

1.7 稳定性检验 随机抽取水平Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的Fib 国家标准品各 14 支，分别于 20 ～ 25 及 2 ～ 8 ℃放置14 和 28 d，37 ℃放置 7、14 和 28 d。水平Ⅰ、Ⅱ使用TECO Coatron 3000 全自动凝血分析仪进行测定，水平Ⅲ使用maccura H-04 凝血分析仪进行测定。以-20 ℃保存的Fib 国家标准品为对照，以各储存条件下国家标准品与对照的Pt 评价标准品的稳定性。

1.8 协作标定 以Fib 国际标准品为对照，对Fib国家标准品（水平Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）进行协作标定。选取9 家实验室（编号：1 ～ 9），其中 6 家实验室采用凝固法，3 家实验室采用比浊法，按各试剂盒说明书进行检测，检测结果采用log-Logit 数学模型进行分析。

2 结 果

2.1 水分 水平Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ Fib 国家标准品的水分均值分别为4.2%、4.8%、4.3%，均＜5%。

2.2 均匀性 水平Ⅰ、Ⅱ、ⅢFib 国家标准品的F 均＜Fcrit，P 均 ＞ 0.05，见表1。水平Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ国际标准品的相关系数分别为-0.999 2、-0.999 2、-0.998 2。10份水平Ⅰ、Ⅱ、ⅢFib 国家标准品的变异系数分别为4.64%、4.38%、4.49%，均 ＜5.0%，见表2。上述结果表明，制备的Fib 国家标准品具有良好的均匀性。

表1 均匀性检测结果的单因素方差分析Tab.1 One way ANOVA of test results of uniformity

表2 均匀性Pt 的变异系数分析Tab.2 Analysis of coefficients of variation of Pt in uniformity test

2.3 稳定性 水平Ⅰ的Fib 国家标准品于2 ～8 及20 ～ 25 ℃条件下保存 28 d 内，Pt 在 0.960 5 ～ 1.018 0之间，37 ℃保存 14 d，Pt 为 0.950 0 和 0.949 4，稳定性均良好。水平Ⅱ的Fib 国家标准品于2 ～8 及20 ～ 25 ℃条件下保存 28 d 内，Pt 在 0.952 7 ～ 1.069 4之间，稳定性良好；37 ℃保存时不稳定。水平Ⅲ的Fib国家标准品于2 ～ 8 ℃保存 28 d、20 ～ 25 ℃保存 14 d、37 ℃保存 7 d 时，Pt 在 0.983 7 ～ 1.027 9 之间，稳定性良好。见表3。

表3 稳定性Pt 的测定结果Tab.3 Test results of Pt in stability test

2.4 协作标定 经9 个实验室的协作标定，水平Ⅰ、Ⅱ、ⅢFib 国家标准品蛋白含量分别定值为：3.7、1.4、0.75 mg ／ mL，见表 4。

表4 Fib 国家参考品协作标定结果Tab.4 Collaborative calibration of national standard for Fib

3 讨 论

Fib 的参考区间为 2.0 ～ 4.0 mg ／ mL，本研究将制备的Fib 国家标准品设置了3 个浓度水平，水平Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别为参考区间上限、参考区间下限和医学决定水平检测限。为便于获得参考范围以外异常低值和高值浓度的标准品，本研究采用冷沉淀法制备Fib国家标准品，从血浆中分离提取Fib，再将其加入至正常血浆中，配制成不同浓度水平的国家标准品。

Fib 检测方法较多，其中酚试剂比色法（jocobsson法）为WHO 推荐的参考方法，第1 个国际标准品是采用该方法定值的，但由于该方法需手工操作，导致国际标准品的精密度较差。随着自动化凝血分析仪的出现和逐渐普及，目前市售的凝固法Fib 检测试剂已有10 多种，也是WHO 和CLSI 推荐的常规测定方法。WHO 建立的第2 个和第3 个Fib 国际标准品是采用该方法定值的。本研究制备的国家标准品也是采用凝固法来定值的。经协作标定，由于部分试剂盒检测水平Ⅰ的结果差异较大，未纳入本次定值，分析原因可能是Fib 浓度高时反应凝固快，不易检测准确；Fib 的医学决定水平浓度较低，为使低水平测试更准确，牺牲了高值的准确性；WHO 标准品的浓度为2.7 ng ／ mL，浓度偏低，即使溯源至WHO标准品，较难确保高值的准确性。另外，免疫比浊法检测试剂盒检测水平Ⅰ的结果偏差较大。因此，不对水平Ⅰ测定值做要求，仅供参考。

综上所述，本实验室成功建立了Fib 国家标准品，包括3 个浓度水平，水平Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ蛋白浓度分别定值为 3.7、1.4、0.75 mg ／ mL，该标准品具有良好的均匀性和稳定性，可用于Fib 凝固法和比浊法试剂盒的准确性评价。