高压复合pH偏移预处理对大豆蛋白糖基化复合物结构及乳化性质影响

谭孟娜, 徐晶晶, 杨雪飞, 高海鸰, 罗水忠, 李兴江, 郑 志

(合肥工业大学食品与生物工程学院；安徽省农产品精深加工重点实验室，合肥 230601)

作为一种价格低廉，营养全面，兼具多种功能性质的植物蛋白，大豆蛋白已被广泛应用于食品加工领域[1]。然而，大豆蛋白的分子构象主要由氢键及二硫键所稳定，形成了致密的球状结构，导致其水溶性和分散性较差，对自身乳化性能造成限制[2,3]。糖基化反应，即羰氨反应是指糖分子的羰基与蛋白质的自由氨基经缩合、聚合后生成多种风味物质的褐变反应，反应过程中无需向体系中添加额外试剂，被认为是一种理想的蛋白改性方法[4]。Liu等[5]利用亚麻籽胶与大豆蛋白进行接枝反应，蛋白溶解性得到显著改善。Li等[6]研究表明与未改性大豆蛋白相比，葡萄糖与大豆蛋白的美拉德反应复合物表现出了良好的分子柔韧性和乳化性能。大豆蛋白紧密的分子结构使部分糖基化反应位点被包埋在分子内部，无法与糖分子的羰基端充分接触，因而会降低糖基化反应效率[5]。因此，在糖基化反应之前通过对大豆蛋白施加适当的处理，可以使其结构充分伸展，增加糖基化反应基团的暴露量，以增大糖基化接枝反应的发生概率[7]。

作为一种非热加工技术，超高压处理被广泛应用于蛋白的修饰和改性研究中[8]。高压处理过程中可诱导蛋白质分子之间化学作用力及各种相互作用之间的转换[9]，使蛋白质结构展开。然而，仅超高压处理对蛋白质的作用效果有限，因此高压处理与其他方式的结合受到关注。pH偏移处理特别是碱性pH偏移处理可显著改善蛋白质结构，当蛋白质溶于极端pH值溶液中时，其分子侧链上带有大量同种电荷，致使蛋白分子因静电排斥作用而发生结构展开，当pH值调回中性时，随着静电斥力的消失蛋白质分子重新发生折叠。再次折叠后的蛋白质结构相较于初始状态较为疏松，功能性质也随之发生变化[10]。已有研究利用超高压处理与碱性pH偏移处理相结合，使蛋白质发生结构展开，不溶性聚集体出现解聚行为[11]。

本研究采用超高压协同碱性pH偏移共同处理SPI，使其结构以较大程度展开，从而增加糖基化反应位点的暴露量，以增大反应几率，再对经预处理的SPI进行糖基化接枝改性，考察不同预处理方式对糖基化产物结构和乳化性质的影响，为改善大豆蛋白的乳化性质提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆分离蛋白(SPI)、麦芽糊精(MD)为食品级；邻苯二甲醛(OPA)、β-巯基乙醇、四硼酸钠、1-苯胺基萘-8-磺酸(ANS)、十二烷基硫酸钠(SDS)、无水乙醇、氢氧化钠、盐酸等其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HHP-M1超高压处理设备，HH-2数显恒温水浴锅，FiveGo 单通道pH计，FD-1A-50冷冻干燥机，Nicolet 67傅里叶红外光谱仪，F2000荧光光谱仪，TU-1901双光束紫外可见分光光度计，Synergy LX多功能酶标仪，FA25高速剪切均质机。

1.3 实验方法1.3.1 糖基化大豆分离蛋白的制备

取4 g大豆分离蛋白溶于100 mL蒸馏水。以2 mol/L NaOH将样品溶液pH值调节至11，磁力搅拌30 min后将SPI溶液密封于聚乙烯袋，放入超高压处理设备中，处理压力梯度分别设置为100、200、300、400 MPa，处理时间设置为10 min。经高压处理后的样品溶液转移至烧杯中，以2 mol/L HCl调节pH值至7。向经高压复合pH偏移处理后的100 mL蛋白溶液中加入2 g麦芽糊精，搅拌均匀后95 ℃加热30 min，冰水浴至室温得到糖基化大豆分离蛋白，各样品记为100Sh-M、200Sh-M、300Sh-M、400Sh-M。未经高压处理(0.1 MPa)而仅经pH 11偏移处理的蛋白与麦芽糊精的糖基化产物记为0.1Sh-M。

相同条件下，仅经10 min高压处理(压力梯度为100、200、300、400 MPa)的SPI样品与麦芽糊精经95 ℃加热30 min得到的糖基化产物记为100S-M、200S-M、300S-M、400S-M。未经任何处理的大豆分离蛋白作为对照组，记为SPI。SPI与麦芽糊精的糖基化产物记为0.1S-M。所有样品于透析袋中(截留量为7 000 U)透析48 h后，进行冷冻干燥。

1.3.2 接枝度的测定

参照Shima等[12]的方法测定样品的接枝度(DG)。OPA试剂的配制：取0.2 g OPA溶解于5 mL无水乙醇，加入0.2 g/mL SDS溶液12.5 mL、10 mmol/L四硼酸钠溶液(pH 9.7)125 mL及β-巯基乙醇500 μL，经混匀后以蒸馏水定容至250 mL。取200 μL样品溶液(0.2%，W/V)与4 mL OPA试剂充分混合，35 ℃水浴条件下保温2 min后，于340 nm条件下测定反应产物的吸光值A1，未经处理的大豆分离蛋白与OPA试剂混合溶液的吸光值记为A0。接枝度(DG)按式(1)计算：

DG=(A0A1)/A0×100%

(1)

1.3.3 褐变程度测定

参照Chawla等[13]的方法，配制2 mg/mL的糖基化蛋白样品溶液，测量时以蒸馏水为参比溶液，使用分光光度计测定各溶液在420 nm处的吸光值。

1.3.4 傅里叶红外光谱测定

取1 mg样品与100 mg溴化钾粉末充分混合并研磨均匀，压片后于红外光谱仪舱室中进行扫描。测试条件为：扫描范围4 000～500 cm-1，分辨率4 cm-1，扫描次数32次。将1 600～1 700 cm-1处红外图谱信息导入Peak fit软件，经基线校正后对图谱去卷积，再进行二阶导数拟合，至相关系数R2的拟合值恒定为止，各二级结构所占百分比含量为其各自对应的峰面积占比。

1.3.5 内源荧光光谱测定

将样品溶液配制为0.5 mg/mL，设定激发波长为280 nm，发射波长扫描范围为300～400 nm，利用荧光分光光度计扫描样品的内源荧光光谱。

1.3.6 表面疏水性测定

参照Zhou等[14]的方法测定蛋白及糖基化样品的表面疏水性。将样品溶于蒸馏水中，质量浓度为0.005～0.05 mg/mL，ANS浓度配制为8 mmol/L。测定前将50 μL ANS溶液加入4 mL样品溶液中并涡旋混匀。设定激发波长和扫描波长分别为365、484 nm。以荧光强度为纵坐标，蛋白质量浓度(mg/mL)为横坐标作标准曲线，直线斜率即为样品的表面疏水性(H0)。

1.3.7 乳化性测定

根据Cameron[15]的方法测定糖基化样品的乳化活力和乳化稳定性。将样品溶于蒸馏水，使其质量浓度为10 mg/mL，取1 mL大豆油与4 mL样品溶液混合均匀，用高速均质机在13 000 r/min下均质2 min，制备完成后立即从乳液底部取样10 μL，与5 mL 1 mg/mL SDS溶液混合均匀，在500 nm处测得吸光值A0。均质结束后第10 min，同样从乳液底部取样10 μL加入到SDS溶液中测得吸光值A10。测量时以1 mg/mL SDS溶液为参比溶液。样品的乳化活性(EAI, m2/g)和乳化稳定性(ESI, min)按式(2)、式(3)计算。

EAI=2×2.303×A0×D/[c×(1-φ×10 000)]

(2)

ESI=A0×10/(A0-A10)

(3)

式中：D为稀释倍数；φ为乳液油相比例；c为乳液制备前蛋白的质量浓度/mg/mL。

1.3.8 数据统计分析

实验每组重复3次，利用SPSS软件对数据作单因素方差分析(ANOVA)，P<0.05时表示差异显著。以Origin 2016软件对数据进行作图。

2 结果与讨论

2.1 不同预处理方式对糖基化产物接枝度的影响

接枝度可衡量糖基化反应的程度，接枝度增加，说明体系中蛋白的自由氨基含量减少[16]。由图1可知，仅高压处理条件下，糖基化产物的接枝度随压力水平的增加而增加。这是因为高压处理可改变蛋白结构，使蛋白分子发生解聚和结构伸展[17]，可发生接枝反应的自由氨基大量暴露于蛋白质分子表面，促使更多的自由氨基与麦芽糊精的羰基发生接枝反应，从而增大接枝程度。仅高压处理可以促进蛋白与糖的接枝反应，这与Zheng等[18]的研究一致。相比单一高压预处理，高压复合pH偏移处理使接枝反应速率加快，并且随着压力水平的增加，接枝度也逐步增大。这可能是因为复合处理过程中，压力水平的增大利于蛋白质结构的展开，自由氨基与羰基的接触几率增大，糖基化反应速率加快。

注：字母不同表示差异显著(P<0.05)，余同。图1 不同预处理对糖基化产物接枝度的影响

2.2 不同预处理方式对糖基化产物褐变强度的影响

美拉德反应过程中通常伴随着褐变现象的发生，这是由于在反应的高级阶段有含氮类棕色化合物生成，这类物质的特征波长为420 nm，因此420 nm处的吸光值可以指示反应的褐变程度[19]。由图2可知，相比于天然SPI与麦芽糊精的接枝产物，对SPI仅作pH 11偏移处理，褐变程度没有变化，说明此时蛋白的展开程度有限。仅对SPI进行高压处理时，经100、200 MPa高压处理后，褐变程度变化不大，当压力达到300 MPa及以上时，褐变程度明显增加。对SPI进行复合处理时，压力水平增加至200 MPa时褐变强度即出现大幅度的增加，表明相较于单一高压处理，复合处理使蛋白分子获得了更为松散、伸展的结构，蛋白与糖的结合几率增大，糖基化反应程度增加，生成了更多深棕色物质，因此420 nm处吸光值增大。

图2 不同预处理对糖基化产物褐变强度的影响

2.3 SPI糖基化复合物红外光谱分析

图3 不同预处理对糖基化产物FTIR图谱的影响

表1为利用酰胺Ⅰ带处的红外图谱信息计算得出的不同糖基化产物的二级结构含量。根据Li等[25]的报道，各二级结构与拟合图谱中各峰的对应关系为：1 648～1 664 cm-1为α-螺旋结构，1 615～1 637 cm-1和1 682～1 700 cm-1为β-折叠结构，1 664～1 681 cm-1为β-转角结构，1 637～1 648 cm-1为无规卷曲结构。各子峰面积占酰胺Ⅰ带总峰面积比例即为蛋白二级结构含量。见表1，相较于对照组SPI，接枝物的α-螺旋所占比例减少，而β-折叠和无规卷曲比例增大，β-转角含量变化幅度较小。蛋白质的糖基化缩合反应位点主要位于蛋白质α-螺旋结构及其附近区域的ε-氨基，故接枝反应发生后复合物中α-螺旋结构含量降低[26]。由表中结果可知，相较于单一高压处理，超高压结合pH偏移处理使更多的ε-氨基参与到了接枝反应中，因此α-螺旋含量下降幅度更大。相较于β-折叠与无规卷曲的结构稳定性来说，α-螺旋的结构稳定性较强，由表1中二级结构含量的变化可推测，糖基化反应前对蛋白施加预处理可以增强后续生成的糖基化产物的分子柔性[27]。

表1 不同预处理对糖基化产物二级结构含量的影响

2.4 SPI糖基化复合物内源荧光光谱分析

蛋白质中色氨酸(Trp)等疏水性氨基酸对自身所处微环境的极性变化敏感度较高，发色团所处微环境偏极性时可导致最大发射波长(λmax)发生红移，猝灭剂(蛋白或溶剂本身)对发色团起到荧光猝灭作用时可降低荧光强度，因此内源荧光光谱可反映蛋白质三级结构的变化程度[28]。由图4可知，接枝物的荧光强度相比于未处理SPI明显降低，Spotti等[29]在对乳清蛋白-葡聚糖共价复合物的研究中也发现了类似现象，并指出色氨酸残基的周围区域易被多糖链所屏蔽[30]。高压处理可使糖基化产物的荧光强度显著降低，并且在复合pH 11偏移处理后，荧光强度下降幅度变大，这是由于复合处理后接枝度增加，更多的麦芽糊精与蛋白发生接枝反应，从而加强了糖分子对色氨酸残基的荧光猝灭作用。未处理SPI的荧光最大发射波长λmax位于352 nm处，而接枝物的λmax均发生了红移，说明接枝反应可改变蛋白质的构象，使蛋白质三级结构趋于松散。这可能是由于复合处理破坏了蛋白质的结构，色氨酸残基暴露量增多，其周围微环境的极性增强[31]。此外，蛋白质二级结构的变化及疏水基团的暴露作用也会导致此现象的发生[32]。

图4 不同预处理对糖基化产物内源荧光光谱的影响

2.5 SPI糖基化复合物表面疏水性分析

表面疏水性是指位于蛋白分子表面直接与极性溶液直接接触的疏水性氨基酸数量，可影响蛋白其他功能性质的发挥[33]。不同预处理条件对蛋白糖基化产物的表面疏水性如图5所示。与天然SPI相比，未经任何处理的SPI与麦芽糊精发生接枝反应后，其疏水性显著降低，这是因为麦芽糊精与大豆蛋白接枝后体系内产生了大量亲水性羟基，复合物的亲水性增加，疏水性则会降低[20]。Zhang等[34]发现大豆蛋白-麦芽糊精的糖基化作用可降低接枝物的表面疏水性，Ma等[32]也发现糖基化反应会抑制疏水基团的暴露，这与本研究结果一致。仅高压处理条件下，随着压力水平的上升，糖基化复合物的疏水性不断升高，有研究表明超高压处理可使蛋白分子内部的疏水性氨基酸迁移到分子表面，从而提高其疏水性[35]。pH 11偏移处理可使糖基化复合物的疏水性显著提高，当引入超高压(100、200 MPa)与pH 11偏移复合处理SPI后，复合物的疏水性明显增加。尽管糖基化反应会降低复合物的表面疏水性，但糖基化前对大豆蛋白的复合预处理可削弱这种作用，使SPI发生结构伸展，内部疏水性基团从蛋白分子内部转移至分子表面，与溶液直接接触的疏水性基团数量增多。当引入的压力水平增加至300、400 MPa时，糖基化反应程度增大，更多的麦芽糊精与大豆蛋白发生共价接枝，被引入的亲水性羟基数量增加，接枝物的表面疏水性进一步降低。

图5 不同预处理对糖基化产物疏水性的影响

2.6 SPI糖基化复合物乳化活性和乳化稳定性分析

蛋白质构象及其在溶液环境中的亲疏水平衡决定了蛋白乳化活性及乳化稳定性的大小[36,37]。乳化活性代表蛋白质在外力作用下参与乳液界面形成的能力，乳化稳定性代表乳液液滴在一定时间内保持分散状态，不发生絮凝和凝聚的能力[38]。由图6可知，糖基化可使大豆蛋白的乳化活性和乳化稳定性得到显著改善。与未经处理SPI直接进行接枝反应后所得糖基化产物相比，SPI经低压力水平处理后再进行接枝反应所得产物，其乳化活性和乳化稳定性提升效果有限，而高压力水平对乳化性质的改善效果更加明显。这可能是因为压力水平较低时，对糖基化反应的促进效果有限。当SPI经高压协同pH 11偏移复合处理后，糖基化产物的乳化活性和乳化稳定性提升效果更加显著。复合处理效果优于单一高压处理的原因可能有两点：一是因为经复合处理后，蛋白分子的空间结构松散程度变大，疏水基团暴露量增多。蛋白乳化过程中，与油相结合的疏水基团数量变多，促进了蛋白在乳液界面的吸附，从而阻止油滴发生聚合，提高其乳化性[39]。二是因为糖基化复合物中接入的糖链可增加蛋白膜厚度，乳化活性剂乳化稳定性得以提高[40]。

图6 不同预处理对糖基化产物乳化活性(EAI)及乳化稳定性(ESI)的影响

3 结论

本实验研究了超高压协同碱性pH偏移处理对大豆分离蛋白糖基化反应的影响。结果表明：单一高压处理或碱性pH偏移处理对糖基化反应的促进效果有限，而二者的复合处理可进一步增大糖基化反应程度，提高复合物的接枝度和褐变程度。相较于未经处理SPI，大豆蛋白经复合预处理后再与麦芽糊精经糖基化反应后所得产物，其乳化活性和乳化稳定性均有所提升。