核桃蛋白对大米淀粉凝胶化及凝胶特性的影响

邹静怡， 尹婷婷， 刘传菊， 聂荣祖， 汤尚文， 张 倩， 豁银强

(湖北文理学院1，襄阳 441053)(襄阳市农业科学院2，襄阳 441057)

大米除了直接以米饭的形式食用外，也常被加工成米粉、米饼等各种特色食品，以大米为基础原料加工食品的品质和营养价值主要取决于大米淀粉等主要组分。由于存在持水力低、脱水收缩、易回生及储藏不稳定等缺陷，淀粉质产品在要求严格的工业化生产中存在一定的局限。随着大米制品消费需求不断增加，人们不断研究寻找新的改善大米淀粉凝胶化和凝胶特性的方法。作为一种简单直接的方式，物理混合蛋白质、亲水胶体等能克服单一淀粉的某些缺陷[1,2]。蛋白质与淀粉通过氢键、疏水性相互作用、范德华力等发生作用，进而改变体系的流变、热特性、淀粉消化率等物化特性，改善凝胶类食品的品质[3,4]。米蛋白通过降低脱水收缩率、增强持水力及抑制淀粉回生等，提高大米淀粉凝胶的品质[5]。基于凝胶化过程中产生的协同强化效果，有研究以淀粉和蛋白质为原料开发了系列具有新型功能特性的小吃和快餐类食品[6,7]。

核桃饼粕是加工核桃油时产生的副产物，含有50%左右的蛋白质，氨基酸共18种，其中8种必需氨基酸含量适中，并含有较多的精氨酸和谷氨酸。核桃饼粕因含丹宁等组分而具有苦涩味，目前主要作为饲料或肥料，可利用核桃饼粕制备蛋白浓缩物和蛋白分离物[8]，而将核桃蛋白应用于食品配方的研究还鲜有报道[9]。如能将其有效地应用于淀粉质食品，不仅能强化产品的营养价值，也可能改善淀粉质食品理化特性和食用品质。目前有关核桃蛋白对淀粉质凝胶化行为及凝胶特性影响的研究鲜有报道。本实验研究核桃蛋白对大米淀粉糊化、流变、热及凝胶质构和水分子状态的影响，探究将核桃蛋白应用于淀粉质食品中的潜力，以期为开发设计具有期望特征的核桃蛋白-淀粉复合物凝胶类食品提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

籼米，市售；核桃粕。

JMLB-100胶体磨，TDL-5-A台式离心机，阔诚800A多功能粉碎机，AR-2000 流变仪，TechMaster快速黏度仪，NM120-025V-I 低场核磁共振分析与成像仪，TA-2000 差示扫描量热仪，TA.XT. Plus 质构仪。

1.2 方法

1.2.1 大米淀粉和核桃蛋白制备

大米淀粉制备参考Huo等[10]的方法。向500 g大米样品中加入1 L 0.3%的NaOH溶液，室温浸泡12 h，用胶体磨湿磨5 min，悬浆于室温下电动搅拌1.5 h充分溶解蛋白质，3 200 g离心15 min，弃上清，向淀粉残渣中再加入1 L 0.3%的NaOH溶液，重复搅拌和离心操作。每次碱液提取离心后，刮去表层黄棕色胶状物。向离心所得淀粉残渣中加入1.5 L蒸馏水分散沉淀，用0.5 mol/L的HCl溶液调pH至中性，3 200×g离心15 min，弃上清。向淀粉残渣中加1 L蒸馏水洗涤，离心后弃上清，重复水洗3次。所得淀粉于45 ℃烘箱中干燥24 h，粉碎过80目筛，所得大米淀粉置于干燥器中室温保存备用。

核桃分离蛋白的制备参考文献[11,12]。100 g核桃粕用500 mL正己烷脱脂，过滤后在通风橱内挥发溶剂，经粉碎机粉碎，过100目筛。向100 g粉样中加入1 L乙醇溶液室温搅拌洗涤1 h，过滤，滤饼于通风橱中干燥，加2 L蒸馏水充分分散，用1 mol/L的NaOH溶液调pH至11，53 ℃磁力搅拌1.5 h，室温下3 200×g离心15 min，用1 mol/L的HCl调上清液pH至4.5，室温静置1 h，3 200×g离心15 min，沉淀用1 L蒸馏水洗涤，3 200×g离心10 min，重复洗涤2次，冷冻干燥蛋白样品经充分研磨后，用自封袋密封后于干燥器中室温保存备用。

1.2.2 糊化特性测定

分别以0%、3%、6%、9%、12%的核桃蛋白代替大米淀粉，混合均匀。每份样品精确称取3.5 g加到预先加有25 g蒸馏水的RVA测试专用铝桶，随即用搅拌器上下搅拌均匀，迅速进行测试。测试程序为：50 ℃保持10 s，以0.2 ℃/s的速度匀速升温至95 ℃，在95 ℃保持150 s后以0.2 ℃/s匀速降温至50 ℃，在50 ℃保持90 s。测试的前10 s搅拌器转速为960 r/min，随后以160 r/min至实验结束。利用仪器自带软件分析得到糊化温度、峰值黏度、崩解值、回生值、最终黏度等糊化特征参数。

1.2.3 流变行为分析

混合样品每份取0.3 g于螺口玻璃瓶内，加5 mL蒸馏水，室温下磁力搅拌30 min，45 ℃搅拌30 min使其预糊化，90 ℃糊化30 min，糊化过程中不时摇动，所得淀粉糊冷却至37 ℃后进行流变测试。40 mm平板夹具，间距1 000 μm，测试温度37 ℃。静态流变：获得剪切速率0.1～100 s-1范围的应力曲线。用Herchel-Bulkley模型对数据进行拟合。

τ=τ0+K(γ)n

式中：τ为剪切应力；τ0为屈服应力；K为稠度系数；γ为剪切速率；n为流变行为指数。

动态流变：收集体系弹性模量(G′)、黏性模量(G″)及损耗因子(tanδ)在0.1～100 rad/s范围的数据值，应力设置为1%。

1.2.4 热特性分析

每份样品称取大约5 mg于差示扫描量热仪专用铝盒中，加蒸馏水使干物质的质量与水的体积比为1∶2，密封后于4 ℃冰箱过夜使其充分水化。以空铝盒作参照，进行DSC测试。吹扫氮气50 mL/min，升温速率为5 ℃/min，温度扫描范围为30～120 ℃。利用Universal analysis 2000软件分析获得相转变的起始温度(To)、峰值温度(Tp)、终止温度(Te)及焓值(ΔH)。

1.2.5 凝胶质构分析

用蒸馏水将混合不同量核桃蛋白的大米淀粉配制成25%的悬液，先45 ℃磁力搅拌30 min，随后于90 ℃加热30 min使其完全糊化，冷却至室温后置于4 ℃储藏24 h使其老化，冷藏样品回复到室温后上机进行穿刺测试。测试参数为：测前速度2.0 mm/s，测中速度1.0 mm/s，测后速度2.0 mm/s，探头类型为P/0.5。以破断力和破断距离分别表征凝胶强度和凝胶的可塑性。

1.2.6 凝胶中水分状态分析

用1.2.5同样的方法制备凝胶样品。每份取5 g左右置于核磁管内上机测试。测试参数：以Q-FID模式校正，用CPMG序列采集样品信号，TD、RFD、RG1、DRG、PRG和NS分别设置为300 050、0.18、20.0、4、1和4。指数衰减曲线反演后得到T2(横向)弛豫图谱，并得到T21、T22和T23不同弛豫时间峰的面积分数A21、A22和A23。

1.2.7 数据处理

每个实验至少重复3次，结果以“平均值±标准差”表示。利用SAS 8.0进行方差分析，根据Duncan多重比较分析样品间是否存在差异，显著性水平设为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 糊化特征

由图1可见，加热到一定温度时，湿热作用引起大米淀粉颗粒膨胀使体系的黏度增加，相对于未添加核桃蛋白的对照样品而言，含核桃蛋白大米淀粉体系黏度增加的速率更大。由于核桃蛋白的主要成分为球蛋白，在中性体系中受到湿热作用倾向于形成纳米级蠕虫样聚集体[13]。大米淀粉中添加乳清白蛋白和大豆分离蛋白也表现出类似的现象，具有亲水性的纳米级球蛋白能够通过亲水作用和氢键等非共价键与淀粉分子相互作用，进而加速淀粉颗粒的膨胀速度[14]。添加核桃蛋白样品的黏度曲线以浓度依赖的方式总体下移，表明特定温度下体系的黏度值随核桃蛋白添加量增加而减小。由于蛋白替代部分淀粉减少了体系中淀粉特别是直链淀粉的有效浓度，添加蛋清蛋白的豌豆淀粉体系也出现类似的情况[15]，结果表明淀粉是决定蛋白-淀粉混合体系糊化黏度的主要因素。

图1 核桃蛋白-大米淀粉RVA曲线

如表1所示，添加核桃蛋白使大米淀粉糊的峰值黏度、谷值黏度、最终黏度等糊化黏度参数均降低，而糊化温度升高，相关参数变化程度随核桃蛋白添加量增加而加剧，当加入12%的核桃蛋白时，峰值黏度、谷值黏度及最终黏度分别降低了30.77%、12.35%和14.65%，糊化温度升高了8.89%。糊化温度是黏度开始升高时的温度，其与淀粉的水结合力密切相关，蛋白竞争性结合了体系中的水而降低了淀粉对水的吸收能力，进而延迟淀粉颗粒的膨胀。添加兵豆浓缩蛋白也会引起大麦淀粉出现类似的结果[16]。峰值黏度主要反映淀粉颗粒的膨胀能力，淀粉颗粒达到最大吸水量时，进一步吸水导致淀粉颗粒崩解而引起黏度降低。崩解值、最终黏度和回生值等黏度参数呈现出类似的变化规律，测试过程中连续加热和搅拌导致膨胀的淀粉颗粒崩解(如鬼态淀粉)，产生崩解黏度，添加的蛋白质形成连续的凝胶网络包裹在淀粉颗粒表面，增强了膨胀淀粉颗粒对机械剪切的抗性而使体系的崩解值降低。这种热糊稳定性增强的原料适合应用到米糊等热食产品。添加核桃蛋白降低了体系的回生值，表明蛋白与淀粉分子间发生了相互作用，阻碍了直链淀粉分子通过氢键重新排列成有序结构。体系的黏度主要受渗出的直链淀粉分子相互缠结作用的影响，但也不同程度地受添加蛋白量和蛋白质特性等因素的影响。核桃蛋白替代了部分大米淀粉，减少了体系的直链淀粉含量，进而降低了体系的峰值黏度、最终黏度及回生值的等糊化黏度参数。添加酪蛋白的玉米淀粉体系[17]及添加豌豆蛋白的豌豆淀粉体系[18]也得到类似结果。

表1 核桃蛋白-大米淀粉糊化特性参数

2.2 流变特性

2.2.1 静态流变

图2为添加不同量核桃蛋白大米淀粉糊的静态流变曲线。所有样品的剪切应力均随剪切速率增加而加大，呈现出假塑性剪切稀释特征。随着核桃蛋白添加量增加，应力曲线整体下移，表明糊的强度减弱。

图2 核桃蛋白-大米淀粉静态流变曲线

采用Herschel-Bulkley模型对不同体系的稳态剪切数据进行拟合，结果如表2所示。所有样品的决定系数(R2)均大于0.99，表明该方程拟合核桃蛋白-大米淀粉糊体系的流变行为拟合度较高。不同体系的流动行为指数(n)为0.32～0.43，均小于单位1，所有样品都表现为非牛顿流体特征；n值随核桃蛋白添加量增加而增大，即体系的假塑性随核桃蛋白添加量增加而增强。随着核桃蛋白含量增加，样品的屈服应力(τ0)和稠度指数(K)均降低，当核桃蛋白质量分数为12%时，两者分别降低了84.13%和58.04%。所有样品糊的屈服应力均大于0，表明体系形成了一定的交联网络或组分间发生了相互交联，流动启动前需要施加一定的力来破坏这些结构。体系的稠度系数随核桃蛋白添加量增加呈下降趋势，表明淀粉分子和蛋白分子间的相互作用比较弱，添加蛋白使体系中淀粉的膨胀力降低而引起K值减小，其可能是核桃蛋白抑制了淀粉颗粒膨胀及直链淀粉的渗出，导致体系的黏度降低。

表2 核桃蛋白-大米淀粉静态流变参数

2.2.2 动态流变

图3为添加不同量核桃蛋白大米淀粉糊的动态流变曲线。不同样品在频率0～100 rad/s范围内的储能模量(G′)均明显大于其耗能模量(G″)，且没有交叉，表现为弱凝胶体的流变特征[19]。所有样品糊的G′和G″曲线均随频率增加而增大，表明测试时样品形成了弱凝胶，黏弹性表现为频率依赖性。添加核桃蛋白使体系的G′和G″曲线以浓度依赖的方式逐渐下移，即在相同频率下样品糊的黏弹性均随核桃蛋白添加量增加而不断降低。添加的核桃蛋白分子位于淀粉颗粒表面，阻碍了淀粉颗粒吸水膨胀及直链淀粉分子渗出形成交联网络，进而使体系的G′和G″均以浓度依赖的方式降低。蛋清蛋白对豌豆淀粉糊[7]及绿豆蛋白对荞麦淀粉糊[20]流变行为的影响也表现类似的现象。

图3 核桃蛋白-大米淀粉糊频率扫描曲线

图3c为样品的损耗因子(tanδ)随频率增加的曲线图。tanδ表现出与G′和G″类似的变化趋势，即所有样品的tanδ均随频率增加而变大。曲线随核桃蛋白量增加整体上移，表明添加核桃蛋白使体系的流变行为表现出更多的液态属性，表明蛋白与淀粉分子间的作用比较弱，较低的应力就可以破坏颗粒间的结合力。整体来说，添加不同量核桃蛋白的大米淀粉糊均形成了弱凝胶体系，随着核桃蛋白量增加，体系的黏性属性增加而弹性属性减弱。

2.3 热特性

由图4可见，所有样品在60～85 ℃之间均出现2个明显的吸热峰，分别为峰G和峰M1，添加核桃蛋白对样品的峰并没有造成明显的影响。大多数情况下淀粉质样品在DSC测试中出现一个典型的吸热峰，部分情况下出现多个吸热峰，目前对多峰产生的机理还没有形成一致的观点。有研究认为，在含水量较少时，峰G和峰M1分别与晶体结构的凝胶化和熔融有关[21]；在中等含水量时，峰G和峰M1分别由淀粉中短程有序的螺旋结构解旋和长程有序结晶熔融形成的吸热峰[22]；在含水量充分的情况下，峰G和峰M1分别由淀粉颗粒无定形区膨胀和结晶区崩解产生的吸热峰[23]，或由热稳定性不同的两种结晶区凝胶化分别产生的吸热峰[24]，也有学者提出其分别由淀粉颗粒内部中心的结晶片层和颗粒周围的结晶片层凝胶化产生的吸热峰[25]。天然淀粉是一种半结晶颗粒结构，结晶区主要由支链淀粉分支的双螺旋堆积而成，无定形区含有一定量的短程螺旋结构。DSC测试过程中，淀粉颗粒吸水溶胀、短程双螺旋结构解旋、结晶结构熔融等均会不同程度地吸收热量，因此表现出不同的吸热峰，吸热峰的形状和位置受淀粉来源和测试条件的影响。

图4 核桃蛋白-大米淀粉DSC 曲线

所有样品的峰G和峰M1在DSC曲线上均为2个区分明显的独立吸热峰，由表3分析可见，随着核桃蛋白加入量增加，峰G的起始温度(T1o)和峰值温度(T1p)呈现出增加的趋势，而焓值(ΔH1)随核桃蛋白量增加而不断减小，加入核桃蛋白对峰G的终止温度(T1e)影响不显著。峰M1的起始温度(T2o)随核桃蛋白量增加呈现出向高温方向偏移的趋势，焓值(ΔH2)与峰G的变化规律相似，不同样品的峰值温度(T2p)和终止温度(T2e)间差异不显著。位于淀粉颗粒表面的核桃蛋白抑制了淀粉颗粒对水分子的吸收，或蛋白变性形成的交联网络结构妨碍了淀粉颗粒吸水发生相变，进而导致T1o、T1p及T2o向高温方向偏移。ΔH1和ΔH2值降低与淀粉含量降低呈非线性关系，表明核桃蛋白和淀粉分子间的相互作用影响了淀粉相变的焓值，核桃蛋白与淀粉分子间形成氢键降低了淀粉颗粒相变所需的热能，进而更少的热量就能使含核桃蛋白体系中的淀粉颗粒完成相变。

表3 核桃蛋白-大米淀粉热特性参数

2.4 凝胶质构

如图5所示，凝胶穿刺曲线时的力随压缩时间延长呈近线性增加。添加核桃蛋白样品的力增加速率略低于未添加的对照组样品，添加12%核桃蛋白样品的增加速率最小，表明添加核桃蛋白使大米淀粉凝胶的硬度略有减小。凝胶硬度是淀粉质食品的一项重要感官属性，其反映糊化淀粉回生程度及凝胶的稳定性大小。添加核桃蛋白影响了淀粉分子间的氢键键合，进而抑制了淀粉的回生，使形成的凝胶体相对软糯。Hank等[26]发现去除大麦淀粉表面的蛋白能够获得硬度更大的凝胶体，该结果从侧面佐证了这一规律。分别以穿刺过程中凝胶破裂时的力和破断距离表征凝胶的强度和韧性，结果见表4。随着核桃蛋白量增加，样品的强度和可塑性均不断减小。凝胶强度表征淀粉凝胶内部分子间作用力的强弱，凝胶强度和韧性均与淀粉分子通过氢键形成的三维网络结构强弱有关，主要受短程回生程度的影响。添加核桃蛋白不仅降低了体系中直链淀粉的有效浓度，也妨碍了淀粉分子间通过氢键作用形成有序的三维网络结构，进而使凝胶的强度和韧性均减小。

图5 核桃蛋白对大米淀粉凝胶穿刺曲线的影响

表4 核桃蛋白-大米淀粉凝胶质构参数

2.5 水分子状态

横向弛豫时间(T2)对水分子运动性的改变非常敏感，常用来表征拥有不同运动性的水分子状态。T2越小表明体系中的水与基质结合得越紧密，水的运动性越低；T2越大，表明体系中水的自由度越大，体系的保水性或持水性越差。添加不同量核桃蛋白大米淀粉凝胶的T2弛豫时间谱如图6所示。所有样品均出现3个峰，不同样品3个峰的位置差异不显著，T21、T22和T23的峰值时间分别出现在0.86、10.72、86.97 ms附近，表明所有样品均存在结合水、弱结合水和自由水3种状态的水分子，各种状态的水在不同体系的运动性大小类似。

图6 核桃蛋白-大米淀粉凝胶水分状态

对不同状态水分子T2弛豫谱峰面积进行积分，不同样品的峰面积比率A21、A22和A23如表5所示。添加核桃蛋白使凝胶体系中结合水含量增加而自由水含量降低，弱结合水含量变化差异不显著。添加核桃蛋白可能阻碍了淀粉分子重新排列再结晶，使体系中淀粉分子通过氢键结合更多的水分子；核桃蛋白分子表面的一些极性基团与水分子通过氢键作用也会引起体系的结合水含量增加。淀粉回生再结晶释放的水分子主要转变成凝胶束缚的自由水，因此对弱结合水含量的影响不显著。

表5 核桃蛋白-大米淀粉凝胶的A21、A22和A23

3 结论

加入核桃蛋白不仅能增加大米淀粉基制品的营养价值，对大米淀粉凝胶化及凝胶的特性也产生了显著的影响。核桃蛋白抑制了淀粉颗粒膨胀及凝胶化过程中直链淀粉渗出，进而使大米淀粉的糊化温度及相变温度升高，而糊化黏度和相变焓值降低。由于干扰了淀粉分子之间的氢键作用，大米淀粉的回生值和崩解值随核桃蛋白含量增加而不断降低，凝胶体呈现出更高的稳定性。静态流变结果显示加入核桃蛋白使大米淀粉糊呈现出更多的液态属性。因阻碍了淀粉糊中直链淀粉的重排再结晶，加入核桃蛋白使大米淀粉凝胶的结合水含量增加，自由水含量、硬度、弹性及韧性均降低。