防己科地不容块根淀粉形态与理化性质的研究

陈 曼， 陈歆蕊， 冯筱玥， 余徐润， 熊 飞， 冉莉萍

(江苏省作物遗传生理重点实验室/江苏省作物栽培生理重点实验室;扬州大学农学院；江苏省粮食作物现代产业技术协同创新中心，扬州大学1，扬州 225009)(扬州大学广陵学院2，扬州 225128)

地不容(StephaniaepigaeaH. S. Lo)又名山乌龟，为防己科千金藤属多年生藤本块根类植物。地不容具硕大的肉质块根，是我国南方的一种传统中药，可用于治疗腮腺炎、胃溃疡、白细胞减少症等[1, 2]。目前，寻找新型植物淀粉资源在食品和非食品等各种工业的发展当中备受关注，因此，明确地不容淀粉形态和理化特征，将对开发地不容的淀粉资源具有重要意义。淀粉是块根植物主要的碳水化合物，在块根植物的生长过程当中，淀粉含量增加使其块根生长膨大增粗[3]。研究表明，块根或块茎植物中的淀粉质量占干质量的30%～88%[4]。目前国内外对于块根和块茎类植物淀粉的研究主要针对马铃薯、木薯、芋头、葛根等[5-7]，主要分析了这些淀粉的组成、分子结构、颗粒形态和晶体结构以及淀粉的糊化特性与老化特性等方面的性质[8]。有研究表明，马铃薯淀粉具有糊化温度低、吸水量大、透明度高等特征[9]；木薯含有相对较高的直链淀粉，经熬煮后不易成糊[7]。鉴于这些良好的理化性质，这些淀粉被广泛用于食品或非食品方面，例如勾芡，做纺织匀浆，食品添加剂或粉丝、点心等各种食品的制作。然而有关地不容淀粉的理化性质的研究鲜有报道。目前地不容主要用于制药，制药后的残渣常常被丢弃，造成资源的浪费，因此收集并研究地不容块根淀粉的形态和理化性质意义重大。

本研究将从云南保山采购的地不容根茎当中提取淀粉，采用理化方法将地不容淀粉与已被广泛研究和应用的小麦A-型淀粉、马铃薯B-型淀粉和豌豆C-型淀粉的特性进行比较，测定其淀粉的结构和功能特性，从而评价地不容淀粉的理化性质，为更好地利用地不容淀粉资源提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

地不容块根：云南省保山市，选取无病虫害，饱满且大小相近的块根作为实验材料；马铃薯块茎：江苏扬州；小麦品种“扬麦13”；豌豆为“中豌6号”；所用化学试剂均为分析纯，所有试剂由蒸馏水制备。

1.2 仪器与设备

S-4800Ⅱ场发射扫描电镜，Image-Pro Plus图像分析软件，D8 Advance 多晶 X射线衍射仪，AVANCE Ⅲ 400MHzWB 固体核磁共振波谱仪，Cary 610 /670 显微红外光谱仪。

1.3 实验方法

1.3.1 块根显微结构观察

根据王忠等[10]的树脂半薄切片法，从地不容中间部分进行横切，使用双面刀片在横切面中心和外周皮处分别截取出2 mm×2 mm×3 mm的组织，立即置于2.5%戊二醛的磷酸盐缓冲液中，于4 ℃的冰箱中固定3 h。然后用磷酸盐缓冲液(PH 7.2)洗涤样品3次。样品经乙醇梯度脱水和环氧丙烷置换后，采用低黏性Spurr树脂浸透与包埋，在70 ℃下聚合12 h。利用Ultracut R超薄切片机切出1 μm厚的薄片，经0. 5%甲基紫染色5 min后于DMLS光学显微镜下观察并拍照。

1.3.2 I2-KI染色

选取新鲜地不容块根，横切成均匀的两半，再用0.3% I2-KI溶液染色1 min，操作均在室温下进行。用D3200数码相机拍摄染色前后的块根横断面。

1.3.3 淀粉分离

参考Peng等[11]的方法提取块根淀粉，将豌豆与小麦种子用蒸馏水浸泡至8 h，新鲜的地不容块根与马铃薯块茎洗净，分别制成浆液。将浆液与蒸馏水混合，并通过8层棉纱布过滤，用0.2%氢氧化钠浸泡，4 000×g离心5 min，重复2次，去除蛋白质。最后用乙醇洗涤样品，置于40 ℃烘箱烘至恒重，最后研磨并通过100目网筛，收集淀粉备用。

1.3.4 淀粉形态观察及淀粉粒度分布分析

用2 mL 50%甘油分散5 mg淀粉颗粒。将淀粉分散液制成临时装片置于显微镜下。在DMLS光学显微镜下，在200×下观察地不容、豌豆及小麦，100×下观察马铃薯，并拍摄分散情况。选择每种淀粉样品的5～6张照片，使用Image-Pro Plus图像分析软件测量淀粉颗粒的粒径(经颗粒中心的最大轴长)，每个样品随机统计2 000个淀粉颗粒，重复3次。

1.3.5 淀粉粒的扫描电镜观察

在1 mL乙醇中加入提取好的少量淀粉样品，并震荡均匀。在铝箔包裹的载物台上的样品凹槽中滴 20 μL 的样品溶液，等待样品完全干燥。然后放入SCD500真空离子溅射仪中镀金，之后在扬州大学测试中心场S4800发射扫描电子显微镜下拍摄1 000倍的照片并观察。

1.3.6 总淀粉含量及可溶性糖含量测定

将样品洗净，用刀切成薄片，先至于40 ℃烘箱中脱去大量水分后，将烘箱温度调至70 ℃烘箱烘干并研磨成粉，过100目筛。4种样品的可溶性糖和总淀粉含量的测定参考Gao等[12]方法稍加修改。称取50 mg淀粉于试管中，加入3 mL 80%乙醇后，水浴震荡并离心，重复2次。合并2次提取的上清液于离心管中,加入适量活性炭在水浴震荡，进行脱色后离心,用80%乙醇定容至8 mL，测定可溶性糖含量。往2次提取所剩余的残渣中加入20 mL蒸馏水并转移至50 mL容量瓶中，加入2 mL 9.2 mol/L高氯酸沸水浴15 min，过滤，再将上清液转入容量瓶中，用蒸馏水定容，测定总淀粉含量。在2个容量瓶中各取溶液100 μL,加入3 mL新配制的蒽酮试剂，沸水浴10 min后室温冷却15 min，利用722分光光度计测定溶液在625 nm处的吸光度值，计算总淀粉和可溶性糖含量。

1.3.7 表观直链淀粉含量的测定

称取10 mg的淀粉样品，向其中加入100 μL的95%的酒精将淀粉分散彻底，然后加入1 mL 1 moL/L NaOH的溶液，再用蒸馏水将混合液稀释10倍，将稀释后的溶液与0.1 moL/L的HCl中和，最后稀释到0.25 mg/L的淀粉原液。吸0.2 mL的淀粉原液，向其中加入3.6 mL的蒸馏水和0.2 mL的KI/I2溶液(称取1.6 g的KI溶解于20 mL的蒸馏水当中，再加入0. 2 g的I2，并将混合液混合均匀)，室温下避光反应30 min后，分别在波长为510 nm和620 nm下测吸光值，计算表观直链淀粉含量。

1.3.8 淀粉膨胀势和溶解度的测定

参考Lu等[13]的方法测定淀粉膨胀势和溶解度。称取50 mg(m1)淀粉，加入称重的离心管(m2)中，加入3 mL蒸馏水后在金属浴中95 ℃加热1 h，10 000 r/min离心5 min，弃出上清液后将沉淀与离心管一起称质量(m3)，在40 ℃烘箱中烘至恒重(m4)，然后转移到70 ℃烘箱中干燥，直至质量不变。膨胀势和溶解度按公式计算。

膨胀势(g/g)=(m3-m2)/(m4-m2)

溶解度=[m1-(m4-m2)]/m1×100%。

1.3.9 傅里叶变远红外光谱分析

称取30 mg淀粉样品，加入2 mL离心管中，然后加入25 uL超纯水并旋涡振荡调成乳液，然后将淀粉匀浆置于取样器上，将超纯水设为参照扫描背景，利用7000傅里叶变远红外光谱仪的衰减全反射(ATR)模式扫描淀粉样品获得波数为1 200～800 cm-1的原始光谱。根据Man[14]等的方法对原始光谱进行了解卷积，得到解卷积光谱。利用Image-Pro Plus 软件对1 045、1 022、995 cm-1处峰的强度进行统计，并计算1 045/1 022 cm-1和1 022/995 cm-1的比值。

1.3.1013C固体核磁共振波谱(13C CP/MAS NMR)分析

利用AVANCE Ⅲ 400WB固体核磁共振波谱仪分析淀粉样品。无定型淀粉以小麦天然淀粉在95 ℃下糊化1 h制得。以四甲基硅烷(TMS)作为化学位移的内标，并把它的化学位移定为零。使用PeakFit软件对波图进行波峰拟合，重复操作3次。参考Tan等[15]的方法计算出结晶峰、无定形峰、V-型单螺旋及双螺旋所占的比值。

1.3.11 X-射线衍射分析

测试借助扬州大学测试中心的相关仪器。将淀粉样品放置于仪器的样品台圆形凹槽中，压片后在D8X-射线衍射仪上进行波谱扫描。衍射角2θ的旋转范围为4°～40°，步长0.6 s。获得XRD波谱后，运用Photoshop CS6和Image Pro Plus计算样品的相对结晶度(RDC)。

RDC=结晶峰面积×100%/(结晶峰面积+无定型峰面积)

1.4 数据处理

所有数据的测定经过3次重复，结果以平均值±标准差表示；采用Origin 2018软件及Photoshop CS6作图；采用IBM SPSS Statistics 22.0的单因素 ANOVA 对数据进行显著性差异分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 块根的形态及淀粉积累观察

地不容块根横切面组织呈米白色(图1a)。I2-KI溶液显示米白色组织中大部分区域被染成紫黑色(图1b)，说明地不容块根组织有大量淀粉积累，且中间部位淀粉分布较多，边缘分布较少。树脂半薄切片显示地不容块根边缘淀粉积累量较少(图1c)，中间部分淀粉积累量较多(图1d)，这与I2-KI组织化学染色结果相吻合。靠近表皮的部分，淀粉粒分散，细胞中淀粉粒间隙相对较大，而中间部分淀粉粒在细胞中分布相对较广，间隙小，填充程度较高，且中间部分的淀粉粒径明显高于靠近皮层中淀粉粒粒径。

注：a为块根的横切面；b为块根I2-KI染色后横切面；c、e为块根表皮附近组织切片；d、f为块根中间部位切片。标尺：a、b为1 cm，c、d为10 μm，e、f为50 μm。图1 地不容块根淀粉I2-KI染色及显微结构图

2.2 可溶性糖、总淀粉和直链淀粉含量及膨胀势与溶解度

由表1可见，4种材料中地不容的总淀粉含量最低，明显低于小麦和马铃薯，数据符合大多数块茎淀粉的报告范围[4]；地不容的可溶性糖含量较高，略高于小麦和马铃薯，但明显低于豌豆；地不容直链淀粉质量分数为25.92%，明显高于小麦和马铃薯淀粉，低于豌豆淀粉。4种不同类型淀粉膨胀势由高到低为马铃薯>小麦>地不容>豌豆，溶解度为马铃薯>豌豆>小麦>地不容。

表1 不同材料总淀粉、可溶性糖、直链淀粉质量分数、膨胀势及溶解度

2.3 淀粉粒的形态及粒度分布

图2为4种淀粉的形态。马铃薯淀粉颗粒较大，形似其块茎状，较小的颗粒呈现卵圆形和圆形，表面光滑。豌豆淀粉粒呈现卵形，表面凹凸不平，但较为光滑。小麦淀粉颗粒扁平圆状，表面光滑。地不容淀粉中较小的颗粒呈现球形，较大的颗粒呈现卵圆形，表面较少有裂纹。由结果可以看出，地不容淀粉的形态与其他淀粉形态较为相似。依据粒径不同可将不同类型淀粉分为小颗粒(<10 μm)，中颗粒(10～30 μm)和大颗粒(>30 μm)3部分。从表2中可知，地不容淀粉粒群体中中颗粒淀粉的含量占比最多，淀粉平均粒径明显小于马铃薯淀粉和豌豆淀粉，但大于小麦淀粉，这与形态学观察结果相符。

图2 淀粉粒扫描电子显微镜图片(标尺：50 μm)

表2 淀粉粒的尺寸

2.4 13C CP/MAS NMR分析

13C CP/MAS NMR可用于研究淀粉晶体结构组成。图3a所示为4种类型淀粉的NMR波谱，可以看出，4种淀粉的波谱相似，在120～50×10-6区有4个明显的峰值区域，包括C1、C4、C2，3，5和C6区域，但不同的淀粉主要在C1区域有明显的区别(图3b)。102.9×10-6处的无定形峰，是淀粉中直链淀粉和脂的存在而产生的，峰值的大小与淀粉的无定型区所占的比例成正相关[16]。小麦淀粉在C1区域的99.7×10-6、100. 5×10-6和101.8×10-6处有3个典型的结晶峰，在102.9×10-6处的无定形峰很明显；马铃薯淀粉在C1区域100. 9×10-6和102.3×10-6有2个结晶峰，102.9×10-6处有1个不明显的无定形峰；豌豆淀粉在99.9×10-6、100. 5×10-6和101.7×10-6处有3个结晶峰，103.6×10-6处有1个无定形峰；地不容在100. 4×10-6和101.7×10-6处有2个结晶峰，在101.9×10-6处有1个无定形峰。地不容淀粉的单螺旋与双螺旋的比例分别为5.95%和28.51%(表3)，其单螺旋比例高于马铃薯，低于小麦与豌豆，而其双螺旋比例高于马铃薯与豌豆，低于小麦。

表3 淀粉的无定型峰、V-单螺旋、双螺旋比例、红外光谱共振峰相对比值及相对结晶度

注：1～5分别表示地不容、碗豆、马铃薯、小麦、无定形。

2.5 淀粉的晶体结构

根据淀粉XRD图谱的特征，可将淀粉分为A-，B-和C-型3种主要类型。A-型主要存在于禾谷类作物淀粉中； B-型主要存在于植物块茎或块根淀粉中；C-型淀粉由A-型和B-型组成，主要存在于豆类植物淀粉中[17]。小麦淀粉和马铃薯淀粉为公认的A-型淀粉和B-型淀粉(图3c)。地不容淀粉和马铃薯淀粉均在5.6°附近出现一个弱峰，15°和22°附近出现中度峰，17°和24°附近出现较强的峰，这是典型的B-型晶体的特征，说明地不容同马铃薯一样属于B-型淀粉。地不容淀粉相对结晶度为21.20%(表3)，与马铃薯淀粉的相对结晶度无显著性差异，但显著高于小麦淀粉和豌豆淀粉。

2.6 淀粉颗粒表层结构有序度分析

由于ATR-FTIR光谱对分子构型及其螺旋结构的变化反应灵敏，因此可以用来定量分析和研究淀粉的结晶结构。图3d所示为小麦、马铃薯、豌豆和地不容淀粉的ATR-FTIR光谱。由图3可知，4种不同类型淀粉在波数1 200～800 cm-1间具有相似的共振峰，但在1 045、1 022、995 cm-1处有差别。1 045、1 022、995 cm-1处的峰分别与晶体结构、非晶体结构和水合碳水化合物螺旋有关[18]，所以淀粉粒共振峰相对强度的比值1 045/1 022 cm-1被认为是晶体/非晶体结构，用来衡量淀粉的结晶程度即有序度；1 022/995 cm-1被认为是非定形/水合碳水化合物螺旋，用来衡量淀粉中非定形碳水化合物结构与有序碳水化合物结构的比例[19]。表3所示为淀粉粒红外光谱共振峰相对强度比值，4种材料中，地不容淀粉1 045/1 022 cm-1的比率最低，而1 022/995 cm-1的比率最高。该结果表明，地不容淀粉表面有序结构度最低，无定型区比例较多。

3 讨论

分析防己科地不容块根淀粉的积累特征及理化性质，组织化学染色表明，地不容的淀粉主要分布在块根中部，这与其显微结构观察结果相同，符合前人研究甘薯块根中淀粉积累特征[20]。虽然地不容的总淀粉含量较小麦、马铃薯、豌豆低，但依然接近50%，且可溶性糖含量高于小麦与马铃薯，说明地不容块根是一种很好的淀粉来源[19]；可溶性糖参与调节植物细胞的渗透压平衡，并对植物蛋白质稳定的调节起重要作用[18]，对人体也有不可或缺的营养和保健作用，其块根对人体也具有较高的营养和保健功能。

地不容淀粉表面较少有裂纹，这与Zhang等[19]的描述有差异，但其形态与马铃薯、豌豆和小麦淀粉的形态相似，较小的颗粒呈现球形，较大的颗粒呈现卵圆形。粒度分布的特征对淀粉的糊化、水解等功能性质有显著影响，进而影响淀粉的加工和利用，是淀粉的重要性状之一[21]。小麦淀粉当中存在两种粒径大小类型的淀粉粒，分别为A-型淀粉粒(1～10 μm)和B-型淀粉粒(10～35 μm)[11]，因此小麦淀粉粒度分布图像为双峰分布。地不容淀粉的粒度分布图像呈单峰状，与马铃薯淀粉、豌豆淀粉相似，而区别于小麦淀粉。将4种淀粉进行粒径大小比较后发现地不容淀粉的粒径明显小于马铃薯淀粉和豌豆，但大于小麦，且淀粉颗粒中大部分分布于10～30 μm。形成该种差异结果的原因除了可能与其遗传基因的表达有关，多数研究还表明，这可能与发育的时期、受到的空间挤压和营养状况等有关[22]。淀粉粒的形态和粒度分布可能影响淀粉的理化性质和相关的功能性质，由此推测，地不容除了不仅可以作为药材，其淀粉也可用于食品加工。

从淀粉的分子结构上来看，支链淀粉的淀粉酶接触位点较多，所以消化率较高，容易被人体吸收；相反，直链淀粉的淀粉酶接触位点较少，不易被人体消化吸收。通过对各种植物的直链淀粉含量测定的数据可知，谷类的直链淀粉约占25%，豆类可达60%；在本实验中，地不容直链淀粉质量分数虽然高于小麦及马铃薯直链淀粉，为25.92%，符合块根植物的直链淀粉含量的范围[4]。但在所有的淀粉植物中，其直链淀粉含量相对较少。直链淀粉较低的食品，其支链淀粉的含量相对较较多，所以地不容淀粉容易被消化吸收。淀粉颗粒表层结构有序度分析也表明地不容淀粉表面有序度最低，由于淀粉表层有序结构的比例很大程度上影响了淀粉的酸解性能，无定型结构相较于有序结构水解速率更快，水解程度更高[23]，地不容淀粉在食用后更容易被人体消化[24]。

马铃薯淀粉在4种淀粉中的溶解度和膨胀势相对来说最大，因为马铃薯淀粉颗粒较大，在加热的过程当中淀粉受到的内部张力较大，所以导致溶解度及膨胀势也比较大[25]。Cai等[26]认为淀粉溶解度与淀粉中直链淀粉的含量呈正相关，本实验中地不容的直链淀粉含量高于小麦淀粉和马铃薯淀粉，但地不容淀粉溶解度的值却低于两者，除了与淀粉的颗粒结构及淀粉粒径大小的限制约束有关之外[27]，还可能是因为淀粉中的直链淀粉的含量越高，使淀粉之间有更强的抗拉伸力，从而使淀粉粒越紧实，水不容易在淀粉颗粒外充满[28]，从而导致溶解度的值较低。

研究表明，单螺旋比例与直链淀粉含量成正相关，双螺旋与支链淀粉含量成负相关关系[29]，且直链淀粉含量越高，无定形短链所占比例越大，从而导致淀粉相对结晶度越低[30]。本试验中地不容淀粉的单螺旋与双螺旋的比例分别为5.95%和28.51%，且相对结晶度为21.20%，高于小麦淀粉和豌豆淀粉的相对结晶度。地不容在100.4×10-6和101.7×10-6处有两个结晶峰，在101.9×10-6处有一个无定形峰，这与Zhang等[19]相关研究相同，符合B-型淀粉的典型特征。在XRD波谱的分析当中，也验证了这一点。

X-射线衍射是描述天然淀粉结晶特征的常用方法[4]。XRD波谱显示地不容和马铃薯均在5.6°附近出现一个弱峰，15°和22°附近出现中度峰，17°和24°附近出现较强的峰，这是典型的B-型晶体的特征，说明地不容同马铃薯一样属于B-型淀粉，符合关于块根及块茎植物淀粉晶体类型的相关报道[18]。由于NMR和X-射线衍射测定的淀粉中的有序结构不同， NMR可以测淀粉中部分短程有序结构而XRD不能，所以NMR测定的相对结晶度比X-射线衍射测定的高，本研究结论也符合Atichokudomchai等[31]的相关结论。

4 结论

地不容块根富含淀粉，主要集中在块根中部，可作为良好的淀粉来源。地不容淀粉具有典型的B-型晶体的特征，与马铃薯类似。地不容具有直链淀粉含量较低，粒径较小，膨胀势和溶解度相对较低，淀粉表面有序度低等特点，使得地不容淀粉容易被消化吸收，可作为肠胃虚弱人群的辅食或应用个人护理用品领域，更好地开发利用不容制药后的残渣淀粉资源。