五味子藤茎中木脂素提取纯化工艺的优化

董培良，许天恩，王蕊娇，韩华

(黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040)

五味子为木兰科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果实，在我国东北及内蒙古地区有着丰富的种类和数量，又称北五味子。五味子作为一种药食同源的药材被广泛应用，具有收敛固涩、益气生津、补气养心之功效[1]。北五味子的干燥藤茎，不仅具有良好的药用价值，还通常被用作调味剂，其可以通过晒干用来代替花椒作调味剂使用，习称山花椒藤[2]。为了增加五味子果实的产量，需要对植株进行修剪，数据显示每年被剪掉的藤茎重达2 500吨以上，这些剪掉的藤茎没有被有效利用，造成了严重的资源浪费[3-4]。而五味子藤茎的化学组分与五味子果实具有很高的相似性[5]，主要包含木脂素、萜类[6-7]、多糖、挥发油[8-9]等。现代研究发现，五味子中木脂素类成分是五味子主要有效成分，具有抗惊厥、抗溃疡、抗氧化、保护脑神经细胞，保护肝脏损伤[10-11]、改善记忆障碍[12-13]等多种药理活性。

目前虽有多篇文献报道了五味子的提取纯化工艺[14]，但对于五味子藤茎的报道并不是很多，五味子在自然培植和野生林木护养过程中大量的藤茎被修剪除掉，造成了极大的药用植物资源浪费。本实验对于五味子藤茎中木脂素的提取纯化工艺进行优化，旨在为寻找五味子果实的替代品，节约药用植物资源，也为相关药物的开发奠定基础。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1100高效液相色谱仪(美国Agilent公司);RE-2000B旋转蒸发仪(瑞德仪器设备有限公司);XPR26DR电子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司);SHA-Z恒温摇床(常州金坛友良仪器有限公司);101A-1E型电热鼓风干燥箱(上海实验仪器公司);DA-2A真空干燥箱(郑州南北实验仪器公司)。

1.2 试药

北五味子藤茎于黑龙江省饶河县采收且经黑龙江中医药大学药学院药用植物教研室樊锐锋副教授鉴定为木兰科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.的藤茎。五味子醇甲对照品(7432-28-2)、五味子醇乙对照品(58546-54-6)、五味子酯甲对照品(58546-56-8)、五味子甲素对照品(61281-38-7)、五味子乙素对照品(61281-37-6)、五味子丙素对照品(61301-33-5)均购于成都埃法生物科技有限公司，纯度均>98%。甲醇、乙腈为色谱级(美国Fisher公司);纯净水。AB-8、D101、DA201、S-8、HPD100、HPD600、HP-20、X-5型大孔吸附树脂均购于东鸿化工有限公司。

2 五味子藤茎木脂素提取工艺优化

2.1 色谱条件

Agilent TC-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm);检测器DVD;检测波长为250 nm;柱温为30 ℃;体积流量1.0 mL/min;流动相条件为乙腈(A)-水(B);0～10 min，A 40%～50%;10～20 min，A 50%～55%;20～30 min，A 55%～70%;30～40 min，A 70%～80%。色谱图见图1。

注：A.混合标准品;B.五味子藤茎样品。1.五味子醇甲;2.五味子醇乙;3.五味子酯甲;4.五味子甲素;5.五味子乙素;6.五味子丙素。图1 混合标准品和五味子藤茎样品HPLC色谱图

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备

分别精确移取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素对照品至容量瓶中，加入甲醇摇匀，超声溶解，并定容于10 mL的容量瓶中，得到浓度为五味子醇甲(203.6 μg/mL)、五味子醇乙(194.1 μg/mL)、五味子酯甲(204.5 μg/mL)、五味子甲素(197.2 μg/mL)、五味子乙素(206.7 μg/mL)、五味子丙素(202.4 μg/mL)的对照品贮备液，置于冰箱4 ℃避光保存。

2.2.2 供试品溶液的制备

将五味子藤茎粉碎过筛，并称取2.0 g，置于100 mL圆底烧瓶中。分别按照正交试验设计下的各条件进行回流提取，提取液通过抽滤得到滤液，将各次滤液合并并旋干浓缩，加甲醇摇匀，超声溶解并定容到容量瓶中，经0.22 μm的微孔滤膜滤过，得到的滤液即为供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察

分别精密吸取对照品贮备液0.5、1、2、3、4、5 mL，置于10 mL容量瓶中，甲醇定容摇匀，经0.22 μm微孔滤膜过渡，得到对照品进样液，按照色谱条件“2.1”进样测定峰面积，进样量为10 μL。以单一对照品浓度(X,mg/mL)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，并得到回归方程如下：五味子醇甲：Y=28 539.1X+8.414 29，R2=0.999 7;五味子醇乙Y=20 293.8X-4.371 43，R2=0.999 8;五味子酯甲Y=26 328.3X-1.871 43，R2=0.999 6;五味子甲素Y=19 840.6X+9.585 71，R2=0.999 7;五味子乙素Y=18 288.3X-1.371 43，R2=0.999 7;五味子丙素Y=22 584.2X-0.585 71，R2=0.999 9。结果表明五味子醇甲在10.18～101.8 μg/mL、五味子醇乙在9.705～97.05 μg/mL、五味子酯甲在10.225～102.25 μg/mL、五味子甲素在9.86～98.6 μg/mL、五味子乙素在10.335～103.35 μg/mL、五味子丙素在10.12～101.2 μg/mL范围内呈良好线性关系。

2.3.2 精密度试验

在色谱条件“2.1”下，分别测定五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素对照品溶液的峰面积，进样量为10 μL，每个对照品分别测定6次。6种木脂素对照品峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为1.41%、1.45%、1.41%、1.33%、1.28%、1.26%，结果表明仪器精密度良好。

2.3.3 稳定性试验

在色谱条件“2.1”下多次测定同一供试品溶液，分别在放置0、4、8、12、16、24 h后重复进样测定，分别测定不同时间点的供试品中6种木脂素的峰面积值，进样量为10 μL。五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为0.56%、0.66%、0.74%、0.72%、0.74%、1.84%。结果表明在24 h内的供试品溶液基本稳定。

2.3.4 重复性试验

取同一批药材五味子藤茎，粉碎过筛，在圆底烧瓶中进行回流提取，按照供试品溶液制备方法“2.2.2”分别制备供试品溶液6份，在色谱条件“2.1”下分别进样测定6种木脂素的峰面积值，并计算相对标准偏差(RSD)。五味子醇甲峰面积的RSD为0.19%，五味子醇乙峰面积的RSD为0.27%，五味子酯甲峰面积的RSD为0.15%，五味子甲素峰面积的RSD为0.16%，五味子乙素峰面积的RSD为0.18%，五味子丙素峰面积的RSD为0.37%。结果表明该方法具有良好的重复性。

2.3.5 回收率试验

称取同一批次已知含量的五味子藤茎粉末6份，分别加入各对照品，按照“2.2.2”方法制备供试品溶液，在相同的色谱条件下，进样量10 μL分别测定6种木脂素含量。五味子醇甲的平均回收率为99.61%，RSD为0.85%，五味子醇乙的平均回收率为98.48%，RSD为1.32%，五味子酯甲的平均回收率为98.93%，RSD为1.33%，五味子甲素的平均回收率为100.41%，RSD为1.17%，五味子乙素的平均回收率为98.65%，RSD为1.58%，五味子丙素的平均回收率为98.57%，RSD为1.63%。结果表明该方法准确性较好，可以进行定量分析试验。

2.4 试验设计与结果

正交试验设计表采用L9(34)，影响因素分别为乙醇浓度、提取时间、乙醇倍数、提取次数，每个影响因素再选择3个不同的水平，以五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素6种木脂素的含量之和作为总木脂素的量。通过绘制的标准曲线计算得到总木脂素含量作为各试验方法的评价指标。因素水平设计见表1。

表1 正交试验设计表

实验结果见表2，以6种木脂素的总含量为指标进行方差分析结果见表3，对木脂素提取有影响的主要因素是乙醇浓度(A)，其次是提取次数(D)，A>D>B>C。所以得出的最佳提取条件为A3B1C1D2，为95%乙醇，使用8倍量，提取2次，每次时间1 h。

表2 正交试验结果表

表3 方差分析表

2.5 验证试验

在得出的最佳提取工艺条件下重复3次试验，对优化后的工艺条件进行验证。结果总木脂素含量分别为22.45 mg/g、21.86 mg/g、22.73 mg/g。平均提取率为22.35 mg/g。

3 五味子藤茎木脂素纯化工艺优化

3.1 五味子藤茎木脂素上样液的制备

将五味子藤茎干燥粉末在上述最佳提取工艺条件下即8倍量95%乙醇提取2次，每次提取1h提取木脂素，过滤提取液，将各次滤液合并浓缩干燥，即为五味子藤茎乙醇浸膏，浸膏加入适量水可以得到五味子藤茎木脂素上样液。

3.2 大孔吸附树脂的前处理

分别称取一定量的S-8、D101、DA201、AB-8、HPD100、HPD600、HP-20、X-5树脂，先要使树脂充分溶胀，加入95%的乙醇溶液浸泡24 h，乙醇溶液和树脂量不低于2∶1。湿法装柱，继续用95%的乙醇冲洗，直到流出液中加水不出现浑浊为止，然后使用蒸馏水继续洗涤直至流出液无明显醇味，将树脂储存于蒸馏水中备用。

3.3 大孔吸附树脂型号的筛选

3.3.1 吸附性能的考察

分别称取经过前处理后的8种大孔树脂(S-8、D101、DA201、AB-8、HPD100、HPD600、HP-20、X-5)各2.0 g，用滤纸吸干，将8种树脂分别置于250 mL可密封的锥形瓶中，加入已测定浓度的木脂素提取液50 mL。将锥形瓶放置于恒温振荡摇床中，于25 ℃，100 r/min下振荡24 h以达到饱和吸附，过滤后回收滤液，测定滤液中6种木脂素总含量，计算吸附量。

3.3.2 解析性能的考察

分别取充分吸附后的大孔树脂，置于250 mL可密封的锥形瓶中，加入50 mL的蒸馏水在25 ℃，100 r/min下恒温振荡2 h，过滤后再加入95%乙醇100 mL，25 ℃下恒温振荡24 h(100 r/min)，合并两次滤液，测定滤液中6种木脂素总含量，计算解析率。结果见表4。

表4 8种类型大孔树脂对木脂素的吸附量和解吸率

由表4结果可知，虽然S-8型大孔吸附树脂吸附量最大，但其解析率并不理想。综合考虑吸附量和解析率两个条件，AB-8型树脂对木脂素的吸附性和解析性都较好，所以选择AB-8型大孔树脂进行接下来的纯化工艺试验。

3.4 AB-8型大孔吸附树脂纯化工艺考察

3.4.1 上样液浓度的考察

分别取10.0 g AB-8型大孔树脂5份，湿法装入树脂柱，柱体积约10 mL，将“3.1”中制备的提取液，配置浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL的上样液，每个浓度取总木脂素含量一定的体积，令其缓慢通过树脂柱进行吸附，流速为1 BV/h，将得到的流出液浓缩后分别测定总木脂素含量，并计算相应吸附量，结果见表5。

表5 上样液浓度对木脂素吸附量的影响

由表5可知，当上样液浓度为2.0 mg/mL时，AB-8大孔吸附树脂对木脂素的吸附能力最大，为16.94 mg/g，所以选择最佳的上样液浓度为2.0 mg/mL。

3.4.2 最大上样量的考察

量取浓度为2.0 mg/mL的上样液100 mL，以1 BV/h的流速通过10.0 g AB-8大孔树脂柱吸附木脂素，分批次收集流出液，每10 mL 1次，共收集10次，回收溶剂，测定其中总木脂素含量。绘制流出液体积与流出液中总木脂素浓度的关系见图2，根据泄露点(即流出液浓度达到上样浓度的10%时的上样液体积用量)确定最大上样量。

图2 泄露曲线

由图2可知，当流出液达到7 BV的时候，其中的总木脂素浓度已经高于上样液中的总木脂素浓度，为0.275 mg/mL，说明此时木脂素已经开始从树脂柱中泄露，所以最大上样量为70 mL。

3.4.3 洗脱剂体积分数的考察

配制浓度为2.0 mg/mL的上样液70 mL，以1 BV/h的流速通过10.0 g AB-8大孔树脂柱吸附木脂素，待完全吸附后，先用5 BV蒸馏水，洗涤除去杂质，然后分别用10 BV的体积分数分别为45%、55%、65%、75%、85%、95%的乙醇以1 BV/h体积流量连续洗脱，收集各体积分数的洗脱液，浓缩后测定各个梯度的洗脱液中总木脂素的含量，计算洗脱率，见表6。

表6 洗脱溶剂体积分数对解析率的影响

由表6可知，随着洗脱剂的体积分数增高洗脱率也不断增高，95%乙醇作为洗脱溶剂的洗脱率最好，所以选择95%乙醇作为洗脱剂。

3.4.4 洗脱剂用量的考察

配制浓度为2.0 mg/mL的上样液70 mL，以1 BV/h的流速通过10.0 g AB-8大孔树脂柱吸附木脂素，吸附完全后，先用5 BV蒸馏水清洗除去杂质，再用100 mL的95%乙醇以1 BV/h体积流量洗脱，分批次收集流出液，每10 mL一次，共收集10次，分别测定总木脂素含量，绘制洗脱曲线。见图3。

图3 洗脱曲线

由图3可知，当洗脱剂体积达到8 BV时收集得到的洗脱液中的总木脂素含量已经很低，所以选择洗脱剂用量为80 mL。

3.5 结果

通过对上述各个工艺参数进行考察，确定五味子藤茎木脂素的最佳纯化工艺条件为AB-8型大孔树脂，上样液浓度为2.0 mg/mL，最大上样量为70 mL，洗脱剂体积分数为95%乙醇，洗脱剂用量为80 mL。

3.6 验证试验

按照已经确定的最佳纯化工艺进行验证性试验，重复做3次，测定洗脱液中的总木脂素含量分别为50.85%、53.61%、53.95%，平均值为52.8%。

4 讨论

目前已知药材五味子的主要药效活性成分是木脂素类成分，国内关于五味子藤茎的研究较少，本实验通过对于五味子藤茎中的有效成分木脂素的提取工艺和纯化工艺进行优化，得到了一个稳定可靠、具有重现性且提取率较高的五味子藤茎木脂素提取纯化路径，为日后进行相关工业生产和完善其药物开发流程提供理论基础。本实验具有广阔的应用开发前景，为充分利用药用植物资源，寻找新的药物选择提供了可能，为将来研发新药提供研究基础。

莫永俊等[15]对于大孔树脂纯化五味子总木脂素的工艺进行了研究，但仅选择了五味子醇甲作为考察指标，采用紫外分光光度法测定。而五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素也具有较强的药理活性[16]并且这6种木脂素在五味子木脂素类成分中含量较高[17]。本实验在此基础上采用高效液相色谱法测定木脂素，并增加了五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素的测量指标，相对于单一成分作为考察指标，考察范围更加全面、完善。

本实验选用6种在五味子藤茎中的含量较高的木质素类成分，将其总含量作为评价指标达到优化五味子藤茎种木脂素的提取工艺与纯化工艺的目的。但仅从提取物中的木脂素含量作为评价指标尚且不足，为进一步开发新药优化五味子藤茎中木脂素的提取路径，应加入药效学与药代动力学研究，结合单一木脂素成分的权重比，使结果更加客观全面。