猪苓多糖对Hp诱导胃黏膜上皮细胞炎症的保护作用

刘 璇，耿 乐，冯小可，蒲美旨，魏睦新

0 引 言

慢性胃炎是临床上最常见的消化系统疾病，其发病率居于各种胃病发病率首位[1]，幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)感染是慢性胃炎的主要致病因素，由Hp感染造成的慢性感染性胃炎被称为Hp相关胃炎(Helicobacterpyloriassociated gastritia, HPAG)[2]。Hp长期感染会造成胃黏膜炎症程度加深，损伤加重，逐步造成胃黏膜肠上皮化生、萎缩甚至胃癌等恶性病理改变，故世界卫生组织已将Hp列为Ⅰ类致癌因素[3]。目前对Hp引起的胃黏膜上皮细胞炎性损伤治疗的有效方法主要是采用铋剂四联疗法杀除Hp，但长期临床观察发现，即使在Hp根除后，被损坏的胃黏膜也无法在短时间内得到修复，因此越来越多研究者开始寻求新的方法来补齐此项短板。

猪苓多糖(Polyporus umbellatus sclerotia, PPS)是中药猪苓提取的多糖类物质，也是猪苓的主要活性物质[4]。本课题组长期运用化痰消瘀方在临床上治疗Hp相关胃炎及Hp感染后胃黏膜损伤，疗效显著；猪苓是化痰消瘀方中的关键药物之一，近年来本课题组对其主要成分猪苓多糖进行了相关研究，Jiang等[5]的研究证实了PPS在体内外对肺纤维化的治疗作用和初步机制，林贞妍等[6]的研究表明猪苓多糖在体外对胃上皮细胞的肠上皮化生有一定的逆转作用。多项研究已证实PPS还具有明确的抗炎作用，例如脂多糖刺激小鼠巨噬细胞系J774细胞后，不同浓度的PPS均能抑制细胞中IL-6、IL-8的高表达[7]；PPS还可以减少肺纤维化组织的炎细胞浸润水平，降低IL-1β、TNG-α等的表达[8- 9]。但其对Hp引起的胃黏膜上皮细胞的炎症是否同样具有保护作用尚不得知，因此本研究拟进行细胞实验，观察PPS对Hp诱导的GES-1细胞产生的炎症是否有保护作用，并探索其初步的作用机制。

1 材料与方法

1.1 菌株、细胞株与主要试剂PPS购买于上海源叶生物科技有限公司，药物纯度98%(UV)。吡咯烷二硫代批甲酸铵(Pyrrolidinedithiocarbamateammonium, PDTC)购买于美国MCE生物科技公司，纯度99.8%，加入二甲基亚砜(DMSO)溶解，配置成10 mmol/L母液，放入-20 ℃保存。全蛋白提取试剂盒(江苏凯基生物)，核蛋白提取试剂盒(上海碧云天)，一抗Betaactin、CXCL/IL-8(Proteintech)，PP65、P65、IκBα(Affinity Biosciences)；核蛋白内参Histone H3(Abcam)； CCK-8试剂盒(Biosharp)；PCR引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。Hp国际标准菌株SS1(Vac A+,Cag A+)由南京医科大学第一附属医院消化科提供。人胃黏膜上皮细胞GES-1(编号：337965)购买于北纳创联生物科技有限公司。

1.2Hp活菌悬液的制备将Hp菌株SS1划线接种于含10%胎牛血清、万古霉素、两性霉素的哥伦比亚琼脂，并将其置于37 ℃含85% N2、5% O2和10% CO2的饱和湿度环境中培养。用接种环刮取Hp混悬在PBS溶液中，经600 nm分光光度计定量后，记录每次不同浓度(CFU/mL)的菌液A值和，制作Hp生长曲线，然后每次根据不同感染复数选取菌液量。每次干预前均做革兰染色等试验证实Hp感染。

1.3细胞感染模型的制备将GES-1细胞置于含10%胎牛血清，1%双抗(青霉素+链霉素)的DMEM高糖培养基中，然后培养在37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中孵育。分别设置对照组、M50组，M100组、M200组，选取处于对数生长期的人胃上皮GES-1细胞株以3.0×105个/孔细胞接种于6孔板中，当细胞贴壁后，除去对照组，其余各组分别按照MOI 50、100、200向人胃黏膜上皮细胞(GES-1)中加入Hp菌液，然后放入37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中孵育。

1.4Hp与GES-1共培养后形态观察选取处于对数生长期的GES-1细胞株以1.5×105个/孔细胞接种于6孔板中，分别设置空白组、Hp模型组，Hp+猪苓多糖中浓度组(PPS-M)。当细胞贴壁后，除去空白，其余每孔以MOI 100加入Hp活菌悬液，同时向PPS-M 组加入2.5 mg/mL猪苓多糖，每孔设置2个复孔，分别选取时间段6、12、24、48 h进行结晶紫染色，观察不同感染时间段Hp与GES-1共培养后的细胞形态。

1.5CCK8检测PPS对GES-1细胞增殖能力的影响将GES-1细胞按照3×104个/孔接种于2个96孔中，设置 PPS不同浓度组(浓度分别为2、4、5、6、8、10、20、40 mg/mL)，并且每组设置6个复孔。分别继续培养24、48 h，加入CCK8试剂，随后用酶标仪在吸光度450 nm处检测光密度(A)值，用Graphpad 8.0. 2分析细胞增值率并绘制柱状图。

1.6CCK8法检测PPS对与Hp共培养的 GES-1细胞增殖能力的影响将人胃黏膜上皮细胞GES -1以2×104个/孔放入96孔板中，分别设置空白组、模型组，Hp+猪苓多糖低、中、高浓度组(药物浓度分别为1.25 、2.5 、5 mg/mL),及 PPS-L、PPS-M、PPS-H，以及Hp+PDTC组(药物浓度：100 μmol/L)记作PDTC组(PDTC的浓度通过阅读说明书和参考相关文献确定[10])。每组设置6个复孔，分别加入Hp(MOI 100)以及不同浓度药物处理细胞，继续培养48 h。加入CCK8试剂，随后用450 nm酶标仪检测读取细胞，按上述方法计算增殖率。

1.7Western blot法检测IL-8和NF-κB通路关键蛋白表达将处于对数生长期的GES-1细胞接种于多个6孔板中，分别设置对照组、M50组，M100组、M200组，除去对照组，其余各组分别按照MOI 50、100、200加入Hp菌液，选取不同时间节点收取细胞。按照试剂盒说明书分别提取核蛋白及全蛋白，并按照BCA试剂盒说明进行蛋白浓度测定。然后进行SDS-PAGE凝胶电泳，PVDF转膜，5%的脱脂牛奶室温封闭。加入一抗后放入4 ℃孵育过夜。次日孵二抗，洗膜后，滴加ECL化学发光液曝光成像，然后使用Image J软件分析。分析不同时间段，不同感染复数Hp刺激GES-1细胞后炎症结果和NF-κB通路关键蛋白表达，选取合适的刺激时间和感染复数，然后按照上述方法在6孔版中进行铺板，设置空白组，模型组，PPS-L、PPS-M、PPS-H组，以及NF-κB通路抑制剂PDTC组(药物浓度：100 μmol/L) 。细胞贴壁后，先加入PPS预处理1 h，再予Hp感染30 min，收集细胞，按照上述方法进行Western blot检测。

1.8RT-qPCR检测各组mRNA的表达以cDNA为模板，加SYBR GreenⅠ(5 μL体系)进行扩增。用GAPDH做标准对照,使用2-ΔΔCT计算基因表达的相对定量。引物序列如下：IL-6上游5′-AACCTGAACCTTCCAAAGATGG-3′，下游5′-TCTGGCTTGTTCCTCACTACT-3′； IL-8上游5′-CATACTCCAAACCTTTCCACCCC-3′,下游5′-TCAGCCCTCTTCAAAAACTTCTCCA-3′； NF-κB 上游5′-AACAGAGAGGATTTCGTTTCCG-3′,下游5′-TTTGACCTGAGGGTAAGACTTCT3′；P65 上游：5′- ATTCCAGTACCTGCCAGATACA-3′,下游引物：5′-CCGCTGAAAGGACTCTTCTTC-3′;IκBα上游引物：5′- CTCCGAGACTTTCGAGGAAATAC -3′,下游引物：5′- GCCATTGTAGTTGGTAGCCTTCA -3′,内参GAPDH上游引物：5′- ATGTCGTGGAGTCTACTGGC -3′,下游引物5′- TGACCTTGCCCACAGCCTTG -3′。

1.9细胞免疫荧光将GES-1 细胞接种于48孔板，设置空白组，模型组， PPS-M组，以及PDTC组，每组设置3个复孔。药物处理细胞后，加入4%多聚甲醛固定细胞。室温封闭1 h后加入NF-κB P65抗体，4 ℃孵育过夜。次日加入抗兔Cy3，室温孵育，洗涤3次，滴加适当抗荧光淬灭剂后于荧光显微镜下拍照观察。NF-κB的染色为红色荧光，细胞核DAPI染色为蓝色荧光。

2 结 果

2.1Hp对胃上皮细胞GES-1炎性损伤

2.1.1Hp与GES-1共培养(MOI100)形态观察结果显示，未加入Hp刺激的GES-1细胞，状态良好，细胞形态为梭形或扁平多边形，呈小岛状成片贴壁生长；加入Hp感染后的GES-1细胞形态发生改变，整体结构紊乱，贴壁细胞减少，细胞间隙增大，细胞周围出现碎片。且随着感染时间增长，这种变化更加明显。而Hp感染的GES-1细胞在加入PPS干预后，贴壁细胞逐渐增多，细胞形态逐渐恢复。见图1。

图 1 Hp(MOI100)对GES-1形态的影响(结晶紫染色 ×100)

2.1.2各组mRNA的表达与对照组相比，M50、M100、M200的炎性因子IL-6、IL-8表达量均升高(P<0.05)。与对照组相比， M50、M100、M200各组IκBα表达量在48 h时降低(P<0.05或P<0.01)，各组的NF-κB及P65的mRNA表达量在共培养48 h时升高(P<0.05或P<0.01)，且表达趋势呈浓度依赖性。见表1。

表 1 Hp诱导的GES-1细胞炎症指标及通路NF-κB的mRNA表达

2.1.3炎性因子IL-8和NF-κB通路关键蛋白表达结果Western blot结果显示，GES-1暴露于Hp后，与对照组相比，M50、M100、M200各组炎性因子IL-8及核蛋白P-P65表达明显升高(P<0.05)，IκBα表达量显著降低(P<0.05)，见图2。

2.2PPS对Hp诱导的GES细胞炎性损伤的作用

2.2.1 PPS对GES增殖及对Hp诱导的GES细胞毒性的影响PPS与GES-1细胞分别孵育24 h和48 h后测试，当PPS浓度在5 mg/mL以内时，GES的细胞活性几乎没有变化，当浓度超过5 mg/mL时，PPS对细胞活性产生较明显的抑制作用(P<0.05)，见图3。同时，GES-1与Hp共培养时发现，与对照组相比，模型组细胞活力明显下降(P<0.05)。而加入药物后的PPS-L、PPS-M、PPS-H以及PDTC组的细胞，细胞增殖活力明显提升(P<0.05)，见图4。

1：对照组； 2：M50组； 3：M100组； 4：M200组

与对照比较， *P<0.05、**P<0.01

1：空白组；2：模型组；3：PPS-L组；4：PPS-M组；5: PPS-H组；6: PDTC组

2.2.2PPS干预后各组mRNA表达结果加入猪苓多糖干预后,与空白组比较，模型组IL-6、IL-8及NF-κB、P65 的mRNA表达水平升高(P<0.05)，IκBα表达量降低(P<0.01)；与模型组比较，PPS-M和PDTC组的IL-6、IL-8及NF-κB、P65 的 mRNA表达降低(P<0.05)；PPS-M和PDTC组的IκBα表达量升高(P<0.05)，见表2。

2.2.3PPS对Hp诱导的GES细胞炎性损伤作用的结果Western blot结果显示，与对照组比较,模型组IL-8及核蛋白P-P65表达水平升高(P<0.05)，与模型组比较，PPS-M组和PDTC组的IL-8及核蛋白P-P65表达降低(P<0.05)。与对照组比较，模型组IκBα蛋白表达水平降低(P<0.05)，与模型组比较，PPS-M和PDTC组，IκBα表达量升高(P<0.05)，见图5。

表 2 PPS影响Hp诱导的GES-1细胞炎症指标的mRNA及通路NF-κB的mRNA表达

2.2.4PPS干预后影响NF-κB入核水平NF-κB通路上的p65的染色为红色荧光，细胞核DAPI染色为蓝色荧光。与空白组相比，模型组NF-κB通路上P65的入核个数增加，如箭头所示。与模型组相比，PPS-M和PDTC组P65入核个数明显减少，见图6。

1：空白组；2：模型组；3：PPS-L组；4：PPS-M组；5: PPS-H组；6: PDTC组

图 6 NF-κB入核水平( ×200)

3 讨 论

几乎所有Hp患者在组织学上均能观察到慢性活动性胃炎的存在，在此基础上，部分患者可进一步发展为消化性溃疡(十二指肠溃疡、胃溃疡)、胃癌或胃黏膜相关淋巴样组织淋巴瘤(MALT)等严重疾病[11]。因此在疾病尚轻浅的阶段及时干预，尽早修复Hp感染导致的胃黏膜炎症，以免其进一步恶化病变，是防治胃癌的关键环节之一，这同样也符合中医“治未病”的治疗原则。

有研究将Hp感染胃黏膜上皮细胞的过程分为三个阶段：定植，免疫逃逸和外膜蛋白[12]。Hp成功定植胃黏膜上皮细胞后，会分泌多种独立蛋白，包括CagA和VacA等[13]。这些毒力蛋白分泌之后，会切割胃黏膜细胞之间紧密的细胞结构[14]，使细胞发生“蜂鸟”样结构变化，产生四型分泌系统T4SS[15]。CagA会通过这种类似针管样的结构进入上皮细胞内部，进而发生一系列的磷酸化反应，使细胞内部结构紊乱，从而激活炎症信号通路NF-κB，促使IL-6、IL-8和TNFα等炎性因子以相关趋化因子过度表达[16-17]，同时这些物质又可以反向活化NF-κB，进一步扩大炎症反应[18]。以上环节可能是Hp感染后导致的胃黏膜炎症状态持续的关键过程，也是可能可以使用药物积极干预的重要防治阶段。

目前研究已证实NF-κB可以增加炎症因子、趋化因子及其相关受体的表达，被认为是刺激免疫系统的重要促炎信号通路[19]。据报导NF-кB 可以参与诱导多种促炎因子的表达(IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-β和TNF-α)[20]。IκB复合物是NF-κB的抑制因子家族，包括IκBα、IκBβ等，IκBα是其中表达量最多的NF-κB通路负反馈因子。沉默状态下，P65-P50二聚体会与IκBα在细胞质中结合，P65核易位被抑制。活化的IκB激酶(即IKK复合体)触发IκBα的磷酸化，进而被降解，其表达量会显著降低。IκBα被降解后，P65-P50二聚体被释放，迅速进入细胞核中，启动相关基因发生转录，诱导下游IL-6和IL-8等炎性因子的表达[21-24]。

已有报导发现Hp刺激胃黏膜上皮细胞后，NF-κB通路被激活，活化的IκB激酶(即IKK复合体)，促使P65发生核易位，作为开关调控下游基因的转录水平[25]，造成胃黏膜上皮的炎性损伤。且有报导发现猪苓多糖可以通过抑制NF-κB信号通路相关分子，降低肿瘤坏死因子TNF-α等炎症因子的表达[25]。因此在本研究中，PPS干预GES-1后的炎症因子的表达，和NF-κB信号通路及其相关分子的变化是实验的重点观察指标。

在本研究中，我们首先运用Hp感染GES-1细胞，观察到NF-κB信号通路被激活，活化IκB激酶触发IκBα的磷酸化进而被降解，与对照组比较，其蛋白和mRNA表达量均显著降低(P<0.05)；当IκBα被活化后，与P65-P50二聚体分离，P65-P50发生核易位，在细胞核内发生磷酸化,本实验结果显示，核蛋白中PP65表达量较对照组显著升高(P<0.05)，同时炎性因子的表达也在Hp感染GES-1细胞后升高，而加入NF-κB通路抑制剂干预的细胞，炎性因子表达比模型组降低，以上结果再次证实，Hp感染GES-1后激活了NF-κB通路，进而诱导炎性因子的过度表达。

中药猪苓(Polyporus umbellatus)，味甘，性淡、平；归属肾、膀胱经，具有利水渗湿的功效。猪苓多糖(Polyporus umbellatus sclerotia, PPS)是中药猪苓提取的多糖类物质，也是猪苓的主要活性物质。现代药理学研究和近年来的多项研究发现，猪苓多糖具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导分化凋亡、抗氧化、护肝抗炎抗纤维化等作用[26]，同时有报道发现，在治疗肺纤维化、慢性肝炎、膀胱癌等疾病中，猪苓多糖可以抑制TNF-α、NF-κB信号通路相关分子的表达[6]。

Hp感染诱导的NF-κB信号通路相关分子的激活在HPAG中同样发挥着关键作用，因此在本研究中，我们首先观察到PPS能对Hp感染后的GES-1细胞的形态，发挥一定的保护作用；同时，我们检测了相关炎性因子的表达和NF-κB通路上重要的转录因子的蛋白和mRNA表达情况。本课题组之前研究发现，PPS浓度为2.5 mg/mL时对胃黏膜上皮细胞有显著的保护作用。因此本研究选择PPS 1.25 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL的作为细胞处理浓度。实验结果显示，Hp感染GES-1细胞后，升高的炎性因子在加入中、高浓度的PPS干预细胞后，炎性因子表达量降低。同时加入中、高浓度的PPS能够显著抑制Hp感染的IκB激酶的活化，抑制了IκBα的降解，降低了炎性损伤细胞模型P65、P-P65的表达。且通过细胞免疫实验，我们观察到与模型组相比，加入中浓度的PPS后，可以抑制P65-P50活化，明显减少P65的入核个数。说明PPS也能在一定程度上抑制NF-κB信号通路相关分子的表达，推测PPS可能可以通过抑制NF-κB信号通路对Hp感染的GES-1细胞发挥抑制炎性因子表达的作用。

综上所述，Hp感染胃黏膜上皮细胞后，NF-κB通路被激活，并启动相关基因发生转录，启动下游炎症因子的表达，这可能是导致Hp感染后慢性活动性胃炎的关键步骤。而PPS可能通过抑制NF-κB信号通路的相关分子表达，进而抑制其下游炎性因子的表达，对Hp感染的胃黏膜上皮细胞发挥保护作用。本研究在一定程度上证实了猪苓多糖在HPAG中的抗炎作用，并初步阐明了其作用机制，补充了猪苓多糖的药理作用，并为其修复被Hp损坏的胃黏膜的临床应用提供了一定的理论基础和实验依据。