妊娠期糖尿病患者血清miR-27、miR-34c与胰岛素抵抗的相关性

桑艳红 郭珏函 焦培林

妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）是孕产妇在妊娠期初次发生糖代谢异常的一种糖尿病，以多饮、多食、多尿为主要临床表现，其发病率较高，可直接威胁母婴健康［1］。目前，GDM 的发病机制尚未完全阐明，有关学者认为其与炎症反应、基因调控及胰岛素抵抗（Insulin resistance，IR）密切相关［2］。研究显示，微小RNA（microRNA，miRNA）与基因转录及表达有关，具有诊治糖尿病类疾病的潜在价值［3］。有关研究显示，miR-27a 是微小RNA-27（miRNA-27，miR-27）家族成员之一，在IR细胞中表达上调，有望成为治疗糖尿病IR 的生物学靶标［4］。微小RNA-34c（miRNA-34c，miR-34c）在2型糖尿病患者中表达下调，其可能通过影响慢性应激反应，进而影响2 型糖尿病及IR 的发生发展［5］。IR 是GDM 发病的重要因素，临床多以稳态胰岛素评价指数（homeostatic model assessment insulin resistance，HOMA-IR）评估IR 水平。孕妇胰岛素抵抗性及敏感性有所变化，检测HOMA-IR 有助于评估IR 及GDM［6］。本研究通过观察GDM 患者血清外泌体miR-27、miR-34c 水平，分析其与IR 的相关性，以期为早期监测GDM 提供参考依据。

1 一般资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年7月至2019年12月郑州大学第五附属医院接收的158 例GDM 孕妇为GDM 组，纳入标准：①患者均符合《妊娠合并糖尿病诊治指南》有关GDM 相关诊断标准［7］；②患者均为单胎妊娠。排除标准：①合并全身感染性疾病、结缔组织疾病、甲状腺疾病、者；②合并心、肝、肾功能严重异常者；③合并恶性肿瘤、自身免疫性疾病、胎盘早剥及前置胎盘等危险妊娠情况者；④孕期使用影响糖代谢药物者。选取同时间段内本院162 例健康孕妇作为对照组。两组孕妇知情同意研究，并签署知情同意书，本研究经医院伦理委员会审核批准后实施。

1.2 主要试剂与仪器

TRIzol Reagent（货号：J44580）购买于上海金穗生物科技有限公司；microRNA 提取试剂盒（货号：845-KS-2030050）购买于北京金达阳光科技有限公司；miRNA QPCR Master Mix（货号：600583）购买于上海嵘崴达实业有限公司。微量紫外可见分光光度计（型号：HY-Drop100）购买于辉因科技（北京）有限公司，实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）仪（型号：QuantStudioTM12K Flex）购买于美国应用生物系统公司（上海），全自动生化分析仪（型号：BS-220）购买于上海恒舜天实业有限公司。

1.3 方法

收集两组孕妇年龄、身高、体重、孕周、产次等信息，计算体重指数等资料。

1.3.1 样本采集

收集两组孕妇空腹静脉血6～7 mL，置于无菌真空管中，均分成两份。一份置于5 mL EP 管中，室温静置30～35 min，4 450 r/min 离心6 min，离心半径10 cm，分离得上层血清，密封保存于-80℃冰箱中，用于miR-27、miR-34c 水平检测；另一份用于检测低密度脂蛋白（Low density lipoprotein，LDL）、空腹血糖（fasting blood glucose，FBS）、三酰甘油（Triacylglycerol，TG）、及空腹胰岛素（fasting insulin，FINS）、高密度脂蛋白（High density lipoprotein，HDL）水平。

1.3.2 qRT-PCR 法检测血清中miR-27、miR-34c表达水平

从-80℃冰箱中取出适量血清样本，冰上冻融，无菌条件下，采用TRIzol 法抽提血清样本总RNA，利用紫外分光光度计检测样本总RNA 浓度、纯度。按照microRNA 提取试剂盒操作说明书反转录合成cDNA。根据miRNA QPCR Master Mix 说明书将cDNA 进行扩增、PCR 检测。miR-27、miR-34c均以U6为内参，其对应引物序列如表1所示。以2-ΔΔCT法计算miR-27、miR-34c 相对量。

表1 miR-27、miR-34c 及内参基因U6 的引物序列Table 1 Primer sequences of miR-27，miR-34c and internal reference gene U6

1.3.3 血糖、血脂检测

利用全自动生化分析仪检测所有孕妇FBS、LDL、TG、HDL 水平，并采用化学发光法检测两组孕妇FINS 水平。利用稳态胰岛素评价指数（homeostatic model assessment insulin resistance，HOMA-IR）评估IR 程度，评估方法：HOMA-IR=FBS×FINS/22.5［8］。

1.4 统计学方法

采用SPSS 25.0 软件进行统计分析。符合正态分布的计量数据以（±s）表示，行独立样本t检验；采用Pearson 法分析GDM 孕妇血清miR-27、miR-34c 表达水平与HOMA-IR 的相关性；采用Logistic回归分析GDM 发生的影响因素。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料及血脂水平比较

GDM 组孕妇体重指数、血清TG、LDL 及HDL水平较对照组高，差异有统计学意义（P＜0.05），两组年龄、产次、孕周比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 两组一般资料及血脂水平比较（±s）Table 2 Comparison of general data and blood lipid levels between the two groups（±s）

表2 两组一般资料及血脂水平比较（±s）Table 2 Comparison of general data and blood lipid levels between the two groups（±s）

组别对照组GDM 组t 值P 值n 162 158年龄（岁）29.96±5.72 29.85±5.57 0.174 0.862孕周（周）26.57±1.60 26.43±1.52 0.802 0.423 TG（mmol/L）1.78±0.77 3.76±1.46 15.472＜0.001体重指数（kg/m2）21.42±2.23 24.55±2.37 12.170＜0.001 LDL（mmol/L）2.51±1.06 3.23±1.82 4.337＜0.001产次（次）1.81±0.73 1.76±0.68 0.634 0.527 HDL（mmol/L）1.54±0.62 1.99±0.78 5.720＜0.001

2.2 两组孕妇血清miR-27、miR-34c 表达水平比较

GDM 组孕妇血清miR-27 表达水平明显比对照组高，miR-34c 表达水平明显比对照组低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 两组孕妇血清miR-27、miR-34c 表达水平比较（±s）Table 3 Comparison of serum miR-27 and miR-34cexpression levels between the two groups of pregnant women（±s）

表3 两组孕妇血清miR-27、miR-34c 表达水平比较（±s）Table 3 Comparison of serum miR-27 and miR-34cexpression levels between the two groups of pregnant women（±s）

组别对照组GDM 组t 值P 值n 162 158 miR-27 1.02±0.33 1.67±0.58 12.360＜0.001 miR-34c 1.04±0.34 0.62±0.27 12.218＜0.001

2.3 两组孕妇胰岛素抵抗相关指标比较

GDM 组孕妇FBS、FINS 和HOMA-IR 水平均明显比对照组高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 两组孕妇FBS、FINS 及HOMA-IR 水平比较（±s）Table 4 Comparison of FBS，FINS and HOMA-IR levels between the two groups of pregnant women（±s）

表4 两组孕妇FBS、FINS 及HOMA-IR 水平比较（±s）Table 4 Comparison of FBS，FINS and HOMA-IR levels between the two groups of pregnant women（±s）

组别对照组GDM 组t 值P 值n 162 158 FBS（mmol/L）4.96±1.35 5.64±1.78 3.856＜0.001 FINS（mIU/L）6.83±2.32 11.26±4.07 11.999＜0.001 HOMA-IR 1.52±0.62 2.80±1.02 13.603＜0.001

2.4 GDM 孕妇血清miR-27、miR-34c 表达水平与HOMA-IR 的相关性分析

Pearson 法相关性分析显示，GDM 患者血清miR-27 表达水平与HOMA-IR 水平呈正相关（r=0.455，P＜0.05），血清miR-34c 表达水平与HOMA-IR水平呈负相关（r=-0.425，P＜0.05）。

2.5 影响GDM 的Logistic 回归分析

以GDM 是否发生为因变量（是=1，否=2），以体重指数、TG、LDL、HDL、miR-27、miR-34c、FBS、FINS 及HOMA-IR 水平为自变量，行Logistic 回归分析，结果显示，体重指数、TG、miR-27、HOMA-IR是影响GDM 发生的危险因素（P＜0.05），miR-34c是影响GDM 发生的保护因素（P＜0.05）。见表5。

表5 Logistic 回归分析GDM 发生的影响因素Table 5 Logistic regression analysis of factors affecting the occurrence of GDM

3 讨论

GDM 发病率较高，可导致产妇发生流产、羊水过多、感染，增加巨大儿、极低体重儿、胎儿畸形、新生儿呼吸窘迫综合症、新生儿低血糖等发生率，对产妇及围产儿生命健康构成极大威胁［9］。本研究显示，GDM 孕妇体重指数、血清TG、LDL 及HDL 水平较高，与陈年芳等［10］研究一致，提示GDM可能与体重指数、血脂异常有关，临床应及时监控女性体重指数、血脂水平，预防GDM 发生。

miRNA 可调控炎症反应、慢性应激、信号传导等生物学过程，其可能是糖尿病、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、GDM 等的诊治靶标［11］。既往研究显示，miR-27 是miRNA 成员之一，其在高脂饮食诱导的肥胖小鼠中表达异常，经类黄酮衍生物治疗后，miR-27 表达发生改变，其可能参与肥胖、糖尿病发生发展［12］。本研究中GDM 组孕妇血清miR-27表达水平明显高于对照组，提示miR-27 可能在GDM 病理发展中发挥重要作用。推测可能原因，miR-27 作为miRNA 成员之一，其可能通过影响慢性应激及胰岛素信号传导过程，从而影响GDM 发生发展。体外研究显示，高葡萄糖处理足细胞后，miR-34c 表达下调；miR-34c 可通过靶向调节有关蛋白表达，进而影响糖尿病性肾病的发展过程，有望成为治疗糖尿病性肾病的靶标［13］。另有研究显示，miR-34c 在1 型糖尿病中表达失调，其可能通过调控自噬过程，从而参与糖尿病角膜病变［14］。以上研究表明，异常表达的miR-34c 可能与糖尿病类疾病相关。此外，Bai 等［15］研究发现miR-34c 通过调节靶标表达，从而影响胰岛素合成及分泌，miR-34c 具有治疗糖尿病的潜在价值。本研究通过比较GDM组及对照组孕妇血清miR-34c 水平，结果显示，GDM组孕妇血清miR-34c 水平明显低于对照组，提示miR-34c 可能参与并影响GDM 疾病进程。

IR 是由多种因素引起胰岛素对葡萄糖摄取及利用率降低的一种状态，其可引发2 型糖尿病、代谢综合征、GDM［16］。研究显示，GDM 患者FBS、FINS 及HOMA-IR 水平均呈高水平，GDM 孕妇对胰岛素敏感性及抵抗性降低，HOMA-IR 是GDM发病的危险因素［17］。Tanaka 等［18］发现GDM 孕妇HOMA-IR 水平明显上调，孕妇IR 可能是影响肥胖和胎盘大小、功能的重要因素。以上研究表明，HOMA-IR 水平异常可能与GDM 发病有关。本研究显示，GDM 患者FBS、FINS 和HOMA-IR 水平均明显高于对照组，与谭晶等［17］研究结果相符，提示GDM 发展过程可能与IR 异常关系紧密。

本研究中GDM 患者血清miR-27 表达水平与HOMA-IR呈正相关，miR-34c表达水平与HOMA-IR呈负相关，提示miR-27、miR-34c 与IR 相互影响，从而共同影响GDM 疾病发生发展。进一步研究显示，体重指数、TG、miR-27、HOMA-IR 是影响GDM 发生的危险因素，miR-34c是影响GDM发生的保护因素。

综上所述，GDM 患者血清miR-27 表达升高，miR-34c 表达降低，miR-27、miR-34c 水平与IR 显著相关，两者可能与IR 相互作用，从而在GDM 发展中起作用。