维甲酸相关孤核受体α（RORα）在头颈部鳞癌中的表达及意义

孙京宇，蔡振林，钱 永

（1. 海南医学院口腔学院2019级硕士研究生；2. 海南医学院口腔学院2020级硕士研究生；3. 海南医学院附属海南省肿瘤医院头颈外科，海南 海口 570311）

头颈部鳞状细胞癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，主要包括鼻咽癌、口腔癌、喉癌、下咽癌及头颈部皮肤的鳞状细胞癌。在全球范围内，头颈部鳞癌约占成人全身恶性肿瘤的8%［1］，但在海南地区，由于鼻咽癌、口腔癌、皮肤鳞癌的高发，致使头颈部鳞癌在全身恶性肿瘤中的占比显著上升［2］。

维甲酸相关孤核受体α（Retinoid orphan nuclear receptor α，RORα）是一种具有多种生理功能的核受体，广泛分布于机体各组织，在器官发育、机体免疫、慢性炎症及肿瘤的发生、发展等一系列病理生理过程中发挥重要作用［3］。近年来大量研究证实，RORα 是一种肿瘤抑制因子，在乳腺癌、肝癌、结/直肠癌等多种恶性肿瘤中不表达或呈显著的低表达［4］。本研究通过观察RORα 在头颈部鳞癌组织中的表达及对体外培养的头颈部鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响，探讨RORα 参与头颈部鳞癌侵袭转移的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料头颈部鳞癌细胞系（SCC4、Hep-2）均为我院实验中心留存；高糖DMEM 培养液、鼠抗人RORα 抗 体、Transwell 小 室、Matrigel 等 购 自GIBCO 公司；胎牛血清、青霉素-链霉素购自HYCLONE 公司；UltraSentive TMSP 超敏试剂盒购自天津三箭生物试剂公司。

1.2 实验方法

1.2.1 免疫组化检测免疫组化染色采用链霉素-生物素（LSAB）免疫酶标法，采用UltrasSentive TMSP 超敏试剂盒。染色前，切片置于60 ℃烤箱中烤片20 min，脱蜡水化后，置枸橼酸缓冲液（0.01 mol·L-1，pH 6.0）中，微波加热至沸腾，10 min×2 次。其余均遵循试剂盒说明书操作。以正常口腔黏膜标本切片作阳性对照，磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作阴性对照。

1.2.2 细胞培养人舌鳞癌细胞株SCC4 和人喉鳞癌细胞株Hep-2 在37 ℃、5%（V/V）CO2、饱和湿度的条件下，在含有10%胎牛血清（FBS）、100 U·mL-1青霉素和0.1 g·L-1链霉素的DMEM 培养基中培养，细胞生长至约80%～90%汇合时，0.25%胰酶消化传代。

1.2.3 RORα 过表达稳定转染株的建立根据GenBank 中 的RORα 基 因 序 列（Accession：NC_000015.10），设计RORα cDNA，构建靶向RORα cDNA 慢病毒载体，转化、扩增、包装后收集病毒颗粒，而后感染SCC4、Hep-2 细胞，经嘌呤霉素筛选后建立RORα 过表达的稳定转染株，荧光显微镜下观察验证转染效率，Western Blot 验证转染后RORα 的表达情况。

1.2.4 RORα激活试验（SR1078干预试验）收集体外培养的人舌鳞癌细胞株SCC4 和人喉鳞癌细胞株Hep-2，待细胞生长至约80%～90% 汇合时，0.25%胰酶消化、传代，并分为两组：SR1078（-）组和SR1078（+）组，分别加入0µmol·L-1和20µmol·L-1的SR1078（20 µmol·L-1的SR1078 干预浓度是预实验筛选出的最佳效果浓度），连续培养48 h 后，收集细胞，Western Blot检测RORα表达水平。

1.2.5 细胞集落形成试验收集对数生长期的SCC4、Hep-2 细胞，DMEM 培养液重悬细胞，浓度为1×105～5×105个·mL-1，取细胞悬液5 mL 接种于直径6 cm培养皿中；接种后预培养24 h，更换培养液；换液时按0 µmol·L-1（Control 组）、5 µmol·L-1、10 µmol·L-1和20 µmol·L-1四个浓度梯度加入SR1078，继续培养，每48 h 更换培养液；连续培养96 h 后，吸弃培养液后以PBS轻洗3次，4%多聚甲醛固定细胞15 min。去固定液后PBS 轻洗2 次，加入适量GIMSA 染色液染15 min，流水缓慢洗去染色液，空气干燥后，显微镜下观察并计数细胞集落。同样，将RORα cDNA组、空载组（Emtpy vector组）及对照组（Control组）的SCC4、Hep-2 细胞按1×106·mL-1的浓度接种于培养皿中，每48 h 更换培养液，连续培养96 h 后，经过同样的清洗、固定、染色等步骤，显微镜下观察结果。

1.2.6 Western Blot收集细胞，提取蛋白后依次经SDS-PAGE 凝胶电泳、转膜、封闭、一抗及二抗孵育、化学增强发光系统（ECL）显色。设β-actin 为内参。

1.2.7 划痕试验收集对数生长期的SCC4、Hep-2细胞，按1×106/孔的密度种植于6 孔板中；培养至大约80%～90%汇合时，以10µL 枪头作划痕，PBS 轻洗3 次以去除脱落细胞；而后将细胞分为SR1078（-）组和SR1078（+）组，分别加入含有0 µmol·L-1SR1078+5%FBS 和20 µmol·L-1SR1078+5%FBS 的DMEM 培养液，连续培养48 h 后观察结果。同样，将RORα cDNA 组、空载组（Empty vector 组）及对照组（Control 组）的SCC4、Hep-2 细胞按照1×106/孔的密度种植于6 孔板中，培养至大约80%～90%汇合时，相同方法作划痕后，加入含有5%FBS 的DMEM培养液，连续培养48 h后观察结果。

1.2.8 细胞体外侵袭试验（Transwell法）细胞体外侵袭试验采用Transwell 法。收集SCC4、Hep-2 细胞，并将其各分为两组：SR1078（-）组和SR1078（+）组；分别给予0 µmol·L-1和20 µmol·L-1的SR1078 进行干预处理，连续培养48 h 后备用。Matrigel 4 ℃溶胶过夜，并预冷枪头；将液化的Matrigel 与无血清DMEM 按1∶5 稀释，吸取50 µL 稀释液铺于24 孔板之Transwell 小室（上室），37 ℃孵育4 h 后以无血清DMEM 水化上室内凝胶30 min；收集备用的两组SCC4 和Hep-2 细胞，以无血清DMEM 洗涤3 次；以5%FBS 的DMEM 制成浓度为5×105·mL-1的细胞悬液，吸取200 µL 细胞悬液加入Transwell 上室；下室中加入含有20%FBS 的DMEM 600µL，培养48 h 后取出Transwell 小室，拭净小室上面的细胞及Matrigel，PBS 轻洗2 次，4%多聚甲醛固定10 min，1%结晶紫染色30 min；镜下观察及拍照，10 倍物镜下任选5 个视野，计数穿膜细胞。同样方法制备Transwell 上室后，将RORα cDNA 组、空载组（Empty vector 组）及对照组（Control 组）的SCC4、Hep-2 细胞以同样方法制备成细胞悬液，接种于Transwell 上室中，其他步骤同上，连续培养48 h后观察结果。

1.3 统计学方法数据采用SPSS 22.0 软件进行分析，计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 RORα 在头颈部鳞癌组织呈低表达或不表达在舌癌及喉癌组织标本中，癌细胞的RORα 呈阴性或弱阳性，而在癌旁正常黏膜组织中，RORα 的表达呈强阳性，RORα主要表达于细胞核（图1）。

图1 RORα在头颈部鳞癌及癌旁正常黏膜中的表达（HE×20）

2.2 SR1078 激活头颈部鳞癌细胞中RORα 的表达本研究所选择的人舌鳞癌细胞系SCC4 和喉鳞癌细胞系Hep-2 中，Western Blot 检测结果均显示，RORα 不表达或仅为极低水平表达；在以RORα 激活剂（SR1078，干预浓度：20 mmol·L-1）对两种鳞癌细胞进行干预处理48 h 后，细胞中RORα 的表达水平显著升高（图2）。

图2 SR1078干预激活头颈部鳞癌细胞中RORα的表达

2.3 RORα 过表达稳定转染细胞株的验证将RORA cDNA 转染头颈部鳞癌细胞，荧光显微镜下观察转染效率后，Western Blot 检测细胞中RORα 的表达，与对照组（Control 组）及空载组（Empty vector组）相比RORA cDNA 组RORα 蛋白表达增加，RORα过表达稳定转染细胞株的建立成功（图3）。

图3 头颈部鳞癌RORα过表达稳定转染细胞株的验证

2.4 SR1078 干预及RORα 过表达对头颈部鳞癌细胞的增殖活性的影响与对照组相比，SR1078干预组的细胞集落随SR1078 的浓度（5 µmol·L-1、10 µmol·L-1、20 µmol·L-1）升高而明显减少，显示细胞的增殖能力受到显著抑制，且抑制作用在一定范围内与浓度呈正相关，组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；而RORα cDNA 组的细胞集落较对照组和空载组同样明显减少，差异有统计学意义（P＜ 0.01）（图4、图5）。

图4 SR1078干预显著抑制头颈部鳞癌细胞的体外增殖

图5 RORα过表达显著抑制头颈部鳞癌细胞的体外增殖

2.5 SR1078 干预及RORα 过表达对头颈部鳞癌细胞体外迁移的影响与SR1078（-）组细胞相比，SR1078（+）组的细胞迁移能力受到明显抑制，划痕两侧的细胞向划痕区迁移较少。而将RORα cDNA组、空载组（Empty vector组）及对照组（Control组）的头颈部鳞癌细胞进行划痕试验时，RORα cDNA组细胞向划痕区的迁移幅度明显降低（图6）。

图6 SR1078干预及RORα过表达均显著抑制头颈部鳞癌细胞的体外迁移能力

2.6 SR1078 干预及RORα 过表达对头颈部鳞癌细胞体外侵袭的影响与SR1078（-）相比，SR1078（+）组的细胞侵袭能力明显受到抑制，侵入Transwell 下室的细胞数明显减少，组间比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。而RORα cDNA 组、空载组（Empty vector 组）及对照组（Control 组）的三组癌细胞进行体外侵袭试验时，侵入Transwell 下室的RORα cDNA组细胞数较另外两组明显减少，差异有统计学意义（P＜0.01）（图7、图8）。

图7 SR1078干预显著抑制头颈部鳞癌细胞的体外侵袭能力

图8 RORα过表达显著抑制头颈部鳞癌细胞的体外侵袭能力

2.7 SR1078 干预及RORα 过表达对肿瘤侵袭转移相关因子的影响收集对照组（Control组）、空载组（Empty vector组）、RORα cDNA组及经过20µmol·L-1SR1078 干预后的SCC4、Hep-2 细胞，分别提取蛋白，Western Blot 检测多种肿瘤侵袭转移相关因子（E-cadherin、MTA-1、β-catenin、MMP-2、MMP-9）的表达。结果显示：与对照组及空载组细胞相比，在RORα 表达激活的RORα cDNA 组和SR1078（+）组两组细胞中，E-cadherin（E-钙黏素）表达显著上调，肿瘤转移相关因子1（MTA-1）、β 连环蛋白（β-catenin）表达水平稍有下调，MMP-2 和MMP-9（基质金属蛋白酶2和9）表达显著下调（图9）。

图9 SR1078 干预和RORα 过表达对多种肿瘤侵袭转移相关因子表达的影响

3 讨 论

孤核受体（Orphan Nuclear Receptor，ONR）是20世纪80 年代末发现的一类无天然配体或尚未发现配体的核受体，是核受体超家族中较为独特的成员［3-5］。目前已发现的孤核受体超过150 种，其中包括维甲酸相关孤核受体（Retinoid Orphan Nuclear Receptors，RORs）亚家族。RORα 是RORs 亚家族中最早发现的受体，因其序列与视黄酸受体类X 受体相似而得名。RORα 广泛分布于机体各组织，能与体内其他生物活性因子协同作用，共同调节细胞的生长、分化与凋亡，对多种组织器官的发育特别是神经系统的发育起关键作用［3-6］。此外，RORα 还参与多种物质代谢的调控，在慢性炎症、机体免疫及肿瘤的发生、发展等一系列病理生理过程中发挥重要作用［3-6］。

近年来已有大量关于RORα与肿瘤密切相关的文献报道，认为RORα 是一种肿瘤抑制因子［3-4，7］。RORα 广泛存在于机体各类组织，但在多数恶性肿瘤中不表达或呈显著的低表达，包括口腔鳞癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、结/直肠癌、前列腺癌及黑色素瘤等常见肿瘤［8-11］。YAMASHITA S 等［12］研究发现，在体外培养的胃癌细胞中，RORα基因出现甲基化而表达沉默；在利用RORα 激活剂（SR1078）干预后，RORα 表达水平显著升高，细胞的体外增殖及侵袭能力均受到明显抑制。DAI J 等［13］报道，RORα 在正常角化上皮细胞中呈恒定的高表达，而在包括口腔癌在内的口腔鳞癌组织及细胞系中却呈显著低表达，且RORα 可通过调控FOXN1 的表达促进角化上皮细胞的分化；而FOXN1是一个公认的促进细胞分化的转录因子，在鳞状细胞癌发生、发展过程中发挥重要作用［14］。ZHENG X 等［15］则在研究中发现，RORα 表达升高可显著抑制口腔癌细胞的体外和体内增殖，而RORα 表达下降则明显抑制P53 蛋白的表达及磷酸化。裴大兵等［16］发现，应用SR1078（RORα 激活剂）对体外培养的胃癌细胞进行干预，可显著抑制胃癌细胞的增殖和体外迁移、侵袭能力。本研究中，我们通过免疫组化检测头颈部鳞癌及癌旁正常黏膜中RORα 的表达发现，在癌组织中RORα 表达水平极低或完全呈阴性表达，而癌旁正常黏膜中则呈阳性表达，且多呈强阳性；而筛选出两种RORα 表达阴性的头颈部鳞癌细胞株后，采用RORα 激活剂——SR1078 对其进行干预，结果显示，SR1078 能激活RORα 在两种头颈部鳞癌细胞中的表达，并且抑制细胞的增殖，抑制效果在一定范围内随浓度升高而增强。此结果与ZHENG X 等［15］及裴大兵等［16］的研究结果基本一致。随后的划痕试验及细胞侵袭试验中，我们同样发现，经过SR1078预处理的癌细胞，迁移及侵袭能力均受到显著抑制，与对照组之间存在显著差异；此结果亦与裴大兵等［16］在胃癌细胞的研究结果完全一致。为了进一步验证RORα 在头颈部鳞癌中的作用，我们根据GenBank 中RORα 基因序列设计RORα cDNA，并通过一系列步骤成功构建RORα过表达的头颈部鳞癌细胞株，并收集RORα 过表达的癌细胞进行了相同的细胞实验，结果显示，RORα 过表达癌细胞的体外增殖活性、迁移及侵袭能力均明显下降，与SR1078 激活RORα 表达的头颈部鳞癌细胞的实验结果基本一致，只是程度稍有差异。

E-钙黏素（E-cadherin）是上皮细胞最重要的表型标记分子，其表达水平下降或丧失是上皮间质化（EMT）或恶性转化的标志性事件［17］。β 连环蛋白（β-catenin）是Wnt/β-catenin 信号通路的核心分子，Wnt/β-catenin信号通路的异常活化在多种恶性肿瘤的发生、发展及侵袭转移中发挥重要作用［18］。而基质金属蛋白酶2（MMP-2）和基质金属蛋白酶9（MMP-9）均属于基质金属蛋白酶家族，为一类Zn2+依赖肽链内切酶，可降解细胞外基质（ECM），而细胞外基质的降解被公认为恶性肿瘤早期侵袭转移的重要标志［19］。研究结果发现，激活头颈部鳞癌细胞中RORα 表达后，癌细胞中的上皮表型分子-E-钙黏素表达显著增强，而MMP-2和MMP-9表达却显著下调，提示RORα 表达丧失可能是通过EMT 机制参与头颈部鳞癌的侵袭转移过程。

综上所述，RORα 表达失活是头颈部鳞癌发生、发展过程中的重要事件。RORα激活剂（SR1078）能激活RORα 在头颈部鳞癌细胞中的表达，并显著抑制两种癌细胞的体外增殖、迁移和侵袭能力。但RORα 的表达与细胞增殖、迁移和侵袭能力抑制之间是否有直接的因果关系，仍需进一步研究证实。