染色体碎裂化在肿瘤中的作用及其检测技术研究进展

李 颖，罗娟娟，2，徐天菡，万绍贵，2

（1. 赣南医学院基础医学院；2. 赣南医学院基础医学院分子病理中心，江西 赣州 341000）

2011 年，STEPHENS P J 等［1］在研究慢性淋巴细胞白血病中发现了一种独特现象，即在一个明显的一次性细胞灾难中获得了数十到数百个涉及局部基因组区域的染色体重排，他们将这种基因组灾难性事件产物称之为染色体碎裂化（Chromothripsis）。染色体碎裂化的具体形成机制尚不清楚，其发生可能与药物、环境电离辐射、氧化应激和病毒感染等因素有关［2］。它的主要特点是染色体上出现大范围的、成簇的基因重排现象，断裂的DNA 末端随意地进行连接，基因频频出现缺失（图1）［3］。经过染色体碎裂化的细胞一般会死亡，仅极少数细胞幸存下来，可能是由于大规模基因组重排让细胞有转化为癌细胞的趋势。这可能与染色体碎裂化产生的一系列后果相关，其中包括癌基因的扩增、抑癌基因的丢失以及融合基因的形成等。染色体碎裂化并不是渐进性的、连续性的遗传变异积累，它可使癌症基因组突然发生改变，同时影响多个基因的功能，是促进癌症发生的一类重要的基因组变异［1，4］。

图1 染色体碎裂化原理图

1 染色体碎裂化在肿瘤中的作用

CORTÉS-CIRIANO I 等［5］使用全基因组分析了38 种癌症类型的2 658 个肿瘤的染色体碎裂化模式，发现了染色体碎裂化在癌症中普遍存在，在多种癌症类型中发生率超过50%。迄今为止，大量文献报道了各种类型肿瘤的发生发展都与染色体碎裂化相关，比如多发性骨髓瘤［6］、乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌、神经细胞瘤等［5］，其中以脑和骨肿瘤多见。染色体碎裂化对这些肿瘤的发生有极大的促进作用，除此之外，还与肿瘤的侵袭转移和不良预后等密切相关［7］。在肿瘤细胞里，染色体碎裂化可发生在一条或几条染色体上，不同类型的肿瘤其出现的位置各不相同（表1）。

表1 染色体碎裂化与肿瘤临床相关性及其在常见染色体上的位置

1.1 染色体碎裂化促进肿瘤进展机制目前为止，研究报道染色体碎裂化推动肿瘤进展的分子机制主要有3种：癌基因扩增、抑癌基因丢失以及融合基因形成。

1.1.1 癌基因扩增基因扩增是指某一个特定基因的拷贝数选择性增加而其他基因的拷贝数并未按比例增加的过程。这在肿瘤中十分常见，癌基因可通过增加基因拷贝数促使肿瘤恶性转化。染色体碎裂化会导致一条或几条染色体被打碎，而这些

碎裂的片段最后去向有3 种：⑴依靠细胞内DNA 修复，碎裂片段按照新的顺序连接，衍生出一条或几条新的染色体；⑵这些小的基因片段可能会被细胞内丢失；⑶作为染色体外DNA（Extrachromosomal DNA，ecDNA）存在于细胞内，碎裂的片段可被组装到双微体中［8］。双微体是ecDNA 中的一种，是无着丝粒、可自我复制的环状DNA［5］。在双微体这种可高度扩增的DNA 环状结构上往往存在癌基因，这就造成细胞内癌基因的拷贝数不断增加，促使肿瘤恶性发展。此外，双微体不但能自我复制，其个别还能再重新整合到染色体上［9］。在骨肉瘤中，染色体碎裂化发生在5 号、12 号、17 号染色体上，5 号染色体上发现RICTOR 癌基因的增加，12 号染色体上可见CDK4 和MDM2 癌基因扩增，17 号染色体出现COPS3癌基因扩增［10］。

1.1.2 抑癌基因丢失抑癌基因是一类存在于正常细胞内可抑制细胞生长并具有潜在抑癌作用的基因。当这类基因在发生突变、缺失或失活时可引起细胞恶性转化而导致肿瘤发生。当细胞内发生染色体碎裂化时，染色体碎裂片段重新排列，可出现部分片段丢失的现象，如果丢失的片段上存在有抑癌基因，就会造成细胞内抑癌基因丢失，最终就可能引起细胞恶性转化而导致肿瘤发生。在脊索瘤和甲状腺癌中，发现了由染色体碎裂化导致的CDKN2A基因缺失［1］。骨肉瘤患者上的17号染色体可检测到抑癌基因TP53和NF1的缺失［11］。

1.1.3 融合基因形成染色体碎裂化可在细胞内形成新的融合基因以及增加融合基因的数量，其形成也与基因重排相关［7］。部分形成的融合基因可成为癌症的诱因，促进癌症的形成。C11ORF 95 和RELA 基因之间的基因融合是室管膜瘤形成的原因，C11ORF 95-RELA 融合基因是因为11 号染色体发生染色体碎裂化导致基因重排而形成的［12］。PERSSON M 等［13］报道了由染色体重排导致的高致癌性MYB-NFIB 基因融合，这种融合基因在头颈部腺样囊性癌中极为重要，可驱动腺样囊性癌肿瘤发展。融合基因可激活原癌基因，还可产生新的调控蛋白，表达新的具有致癌作用的蛋白质。LEE J J等［14］在研究非吸烟者中引起肺腺癌的突变过程中发现，EML4-ALK融合基因就具有此作用。

1.2 染色体碎裂化导致肿瘤耐药的产生SHOSHANI O 等［8］对产生耐药性的细胞进行了全基因组测序，揭示了染色体碎裂化会促使携带抗肿瘤药物基因的双微体形成，从而产生抗肿瘤治疗的耐药性。染色体碎裂化将染色体内扩增转化为染色体外扩增，然后扩增的双微体可重新整合到染色体新的位置，以应对化疗或放疗造成的DNA 损伤。在治疗药物浓度不断增加的情况下，肿瘤细胞通过重复的染色体碎裂化来驱动初始双微体的结构不断进化，而新产生的双微体则会通过增加目标基因（即耐药基因）的拷贝数来加强细胞的耐药性［8］。现有研究报道，在神经胶质瘤中能观察到由于染色体碎裂化导致的耐药性克隆，该肿瘤产生耐药的机制，跟染色体碎裂化产生双微体有关［15］。此外，多发性骨髓瘤的耐药性也与染色体碎裂化有关，在耐药细胞中可见明显的拷贝数改变［6］。

2 染色体碎裂化检测技术

如果能准确检测出染色体碎裂化具体位置，对研究肿瘤的发生发展将有很大帮助。染色体碎裂化检测技术可分为常规检测技术（表2）与高通量基因测序检测技术（表3）两大类。常规检测技术包括有荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）、外周淋巴细胞G 显带核型分析和染色体微阵列技术（Chromosomal microarray analysis，CMA）。高通量基因测序检测技术包括有下一代测序技术（Next generation sequencing，NGS）以及长读长基因测序技术。在检测染色体碎裂化技术上，长读长基因测序技术占有更大的优势。

表2 染色体碎裂化常规检测技术

表3 染色体碎裂化高通量基因测序检测技术

2.1 常规检测技术

2.1.1 荧光原位杂交FISH 是基因定位和描绘染色体畸变的重要工具，随着该技术灵敏度、特异性和分辨率的提高，原始FISH技术逐渐多样化［16］。在染色体碎裂化研究中，使用了不同的FISH 技术，每种技术都有针对衍生染色体结构鉴定的特定优点。多色FISH 分析（Multicolor FISH analysis，M-FISH）和光谱核型分析（Spectral karyotyping，SKY）用于不同荧光染料结合的全染色体探针，可识别参与复杂染色体重排的所有染色体［17］。SKY 和FISH 与基因座特异性探针的组合用于细胞发生染色体碎裂化时确定衍生染色体的结构［1］。此外，M-FISH 可通过染色体的片段特异性条带来确定异常染色体的结构［17］。这些方法的优势是分析发生在单个细胞水平的染色体碎裂化时，既可检测群体中的罕见畸变，又可评估异质群体的核型；不足之处在于不能检测到范围小的染色体畸变与结构倒置［17］。

2.1.2 染色体微阵列分析CMA也是一种在检测染色体碎裂化方面比较有效的技术，目前，微阵列中的比较基因组杂交（Comparative genomic array hybridization，CGH）是应用最广泛的CMA技术，它也被称为“虚拟核型分析”或“染色体微阵列分析”［2，18］。CGH基于两个DNA样本的直接比较，从而检测基因组中拷贝数的变化。在分析过程中，测试DNA 与参考DNA 被切成小片段，然后用特定的染料标记这些片段，标记的DNA 在芯片上发生杂交，最后检测每个点发出的荧光强度［19］。CGH 为自动化分析，检测周期短，分辨率高，能检出绝大多数染色体不平衡重排［20］。若将其与单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）阵列相结合，不仅可确定DNA拷贝数，还可确定研究样本的杂合性［18］。SNP 阵列通过高分辨率评估整个染色体的异常，具有广泛的异常检测范围［6］。在发生染色体碎裂化的染色体上，拷贝数最低的区域通常就会表现出杂合性的丧失［17］。然而，CGH 方法仍然有它的局限性，它不能检测出平衡性染色体重排（倒位与平衡易位）［19］。

此外，还有分子倒置探针技术，它是指线性的单链DNA 序列探针与靶向序列基因组杂交形成环状结构，用来捕获目标序列的分子生物学技术［20-21］。分子倒置探针技术的探针是一段较长的单链DNA序列，该序列能与靶向序列互补形成含有一个核苷酸至几百个核苷酸缺口的环状结构。以4种游离的

核苷酸（dATP、dTTP、dGTP 和dCTP）为原料，在DNA聚合酶作用下以靶向序列为模板填补缺口。DNA连接酶催化探针两端的3'，5'-磷酸二酯键，形成完整的环化探针；环化后，未使用的探针和基因组DNA 被核酸外切酶有效地从反应中去除，只留下环化的探针。以滚环或线性方式扩增的PCR 产物可与微阵列杂交，而后从与微阵列杂交信号中获得拷贝数多少［20，22］。最后，将得到的拷贝数状态，根据染色体碎裂化的推断标准，得出是否存在染色体碎裂化［21］。CHEN H 等［21］在原发性乳腺癌中用分子倒置探针微阵列技术进行了全基因组拷贝数变化的分析，根据染色体碎裂化推断标准记录染色体碎裂化模式状态，检测出了HER2 的扩增与17q12 处的染色体碎裂化模式有关。

2.1.3 外周淋巴细胞G 显带核型分析临床上检测染色体碎裂化，可采用外周淋巴细胞G 显带核型分析方法。这种技术可识别染色体数量和结构异常，包括易位和倒位［17］。这种方式也适用于单个细胞，但在分析具有染色体碎裂化细胞的情况下，染色体多重变化的复杂性可能限制了G显带核型分析的使用。为弥补这方面的缺陷，可考虑综合多种遗传分析方法对染色体碎裂化进行检测［17］。

2.2 高通量基因测序检测技术

2.2.1 下一代基因测序技术NGS 主要是指第二代基因测序技术，基于二代测序技术形成了几个分支技术：全基因组测序（Whole genome sequencing，WGS）、全 外 显 子 测 序（Whole exon sequencing，WES）、RNA 测序（RNA sequencing，RNA-seq）、染色质免疫共沉淀测序（Chromatin immunoprecipitation sequencing，Chip-seq）［23-24］。但用于检测染色体碎裂化的NGS 的最佳选择是WGS，因染色体碎片化是一种混乱的复杂重排，其中许多基因组片段被重排成衍生染色体。当前分析染色体碎裂化的方法通常需要手动检查以重建整个重排。复杂重排的检测和重建方法需要从全基因组测序数据中表征致病变异，而其他测序技术可用数据可能不足以可靠地推断出染色体碎裂化［25-26］。WGS基于对大量基因的短片段进行扩增，总体上覆盖整个基因组，然后进行测序［17］。随后用获得的数据通过程序软件ShatterProof［27］、ShatterSeek［5］等处理，从而检测出染色体碎裂化。CORTÉS-CIRIANO I 等［5］基于全基因组测序数据去比较不同肿瘤类型的染色体碎裂化的发生率，使用了ShatterSeek分析2 543例肿瘤病例（共37种肿瘤类型），检测肿瘤中是否存在染色体碎裂化，继而得出不同肿瘤类型的染色体碎裂化发生率。此外，有文献报道在研究食管腺癌的发生机制中，不仅用WGS在食管腺癌病例中检测出染色体碎裂化，还可通过食管腺癌病例的WGS 结果，推断出癌基因的扩增是由于染色体碎裂化衍生的双微体所致［28］。

NGS 采用全基因组分析，有比较高的分析精准度，能准确识别出断点位置，并且获得断点的核酸序列数据［17］。尽管如此，NGS 仍然有它的局限性。NGS 多为高通量短读测序检测染色体异常，对于有高度相似的重复序列染色体碎裂化，短读测序检测就存在缺陷，在精确识别序列级变化方面存在困难［26］。此外，它的分析成本高，方法复杂，很难检测出发生较大的染色体易位、删除片段［17］。

2.2.2 长读长基因测序技术长读长基因测序技术主要指的是第三代基因测序技术，第三代基因测序技术是指单分子测序技术。DNA 测序时，不需经过PCR 扩增，实现了对每一条DNA 分子的单独测序。目前的长读长基因测序技术是以PacBio SMRT测序技术和ONT 长读长测序技术为代表，它们都具有比NGS 长的读取长度［29］，在检测染色体结构性变异上有很大优势［30］。

染色体碎裂化是一个发生在染色体上的大量基因重排事件，无论重排是以何种方式出现，结果都是重复、删除、重新排序或重新定向片段［26］。所以，我们检测染色体碎裂化，就需要先找到可与检测基因片段作对照的参考基因组，确定它们之间的“等效”位置，对齐它们（图2）［31］。具体来说，就是通过推断每个读取的基因片段来自参考基因组的哪一部分，将长片段的DNA 读取与参考基因组进行比较，将读取片段准确地分成一个或多个部分，并将每个部分与基因组对齐，找到任意重排，进行比对，看是否有片段的丢失、重复、易位等改变，然后对重排的基因片段进行排序和定向，以完全重建衍生染色体中的复杂重排［26，31］。在比对读取基因片段与参考基因片段的过程中，需了解读取和基因组之间的小插入、缺失和每种核苷酸替换的比率，计算每个碱基错误对齐的概率，找到最可能的划分和对齐［31-32］。长读长测序技术可精确检测断点，表现出破碎的碎片是如何排序和定向的，弥补了短读长测序技术在检测复杂重排上的缺陷［26］。

图2 长读长测序技术检测染色体碎裂化

最近，由MITSUHASHI S 等［26］组成的研究团队使用纳米孔长读长测序仪PromethION对4例具有相互染色体易位患者的基因组DNA 进行了测序，所选择的这4例染色体易位患者均为难以通过包括微阵列和短读长测序在内的传统方法确定精确的断点。在使用纳米孔长读长测序的过程中，他们用新开发的软件Dnarrange 查找相对于参考基因组具有重排的DNA 片段，以及重叠相同重排的基因组片段，从而发现这些患者的DNA 序列重排。然后，他们使用Lamassemble 将每个基因组的片段合并到一个共有序列中，并与参考基因组重新对齐，检测出重排。当存在复杂染色体重排时（即需要一组以上的参考基因组重排读取了解重排的完整结构），使用Dnarrange-link 推断多个读取基因组的顺序和方向，以了解整个染色体的重排，重建衍生染色体［26］。此外，LEI M 等［33］也使用了PromethION 进行纳米孔长读长测序，通过Dnarrange分析管道检测出患者在生殖细胞中发生的复杂染色体碎裂化。

总之，高通量测序技术是目前应用较广泛的测序技术，其中长读长测序方法优于常规检测方法和NGS，因它可检测到准确的断点，识别较复杂重排，对碎裂片段及进行排序和定向，以及检测平衡的染色体重排［26］。

3 总结与展望

染色体碎裂化是促进癌症发生的一类重要的基因组变异，在经过一次性数十个至数百个基因重排后，细胞一般会死亡，但也有幸存下来的细胞，这些细胞大概率会转变为癌细胞。染色体碎裂化的发现，使我们对肿瘤的发生发展有了一个新的认识，为我们日后研究肿瘤的发生机制以及临床诊断治疗及预后的判断有一个新的方向。现已有数据表明染色体碎裂化对患者预后的影响，但还需更多的研究全面评估染色体碎裂化潜在的临床价值。多发性骨髓瘤和神经母细胞瘤的报道分析表明，染色体碎裂化与临床肿瘤不良预后有明显的相关性［34-35］，可通过对活检组织的基因分析检测染色体碎裂化，从而评估临床肿瘤患者的预后。分子靶向治疗能利用染色体碎裂化产生肿瘤的机制，包括癌基因扩增及融合基因的形成等，以肿瘤某些标志物分子为靶点，选择针对性的阻断剂，干预该标志性分子的调控，从而抑制肿瘤的进展［36］。未来染色体碎裂化可能成为分子靶向治疗肿瘤的新视角。

准确检测出染色体碎裂化，有利于肿瘤发生机制的研究。常规检测技术中应用较多的是通过微阵列与其他分子检测技术相结合实现对染色体碎裂化的检测，但高通量基因检测技术的应用有更为广阔的应用前景。第三代基因测序技术是以长读长测序为特点。在检测染色体碎裂化上，能弥补短读长基因测序技术和一些常规的染色体碎裂化检测技术的不足。在第三代基因测序技术中，纳米孔单分子测序技术读长更长，建库方法灵活多样，可作为日后测序技术的发展趋势。尽管如此，长读长测序技术对于更为复杂的较大染色体碎裂化的重排（例如着丝粒或端粒重复）仍不能有效检测［27］，还需我们研发出更新的测序技术手段。