基于气相色谱法指纹图谱和气相色谱-质谱联用识别的温阳扶正散质量控制方法研究

杨思成 黄 菊 周仲瑜 黄 伟 陈树和 段雪云 刘国秀 翟华强 孙婉瑾 黄正德

1.湖北中医药大学药学院，湖北武汉 430065；2.湖北省中医院 湖北中医药大学附属医院 湖北省中医药研究院针灸科，湖北武汉 430061；3.湖北省中医院 湖北中医药大学附属医院 湖北省中医药研究院药事部，湖北武汉 430061；4.北京中医药大学中药调剂标准化研究中心，北京 102488

随着祖国医学的发展，人们对体质的研究也越来越深入，WHO 调查结果显示，全世界人口中，处于亚健康状态的人数高达75%，而痰湿质和阳虚质在总调查人群中人数最多，分别为17.03%、16.30%[1]。阳虚质患者主要表现症状为精神不振、睡眠时间偏多、平素畏冷等。痰湿质是肥胖发生的病理基础[2-3]。

“阴阳调理灸法”创始人，湖北省中医院针灸科周仲瑜教授认为调理患者亚健康状态关键在于纠正患者偏颇体制，治疗阳虚质及痰湿质当以温阳散寒、健脾祛湿为基本原则。因此，周教授结合其多年理论钻研成果及丰富的医疗临床经验，创立温阳扶正散，该方由附子、丁香、干姜、肉桂、吴茱萸，按照一定比例调配而成。通过外用温灸，使患者皮肤更有效地吸收药物成分，用于调理人体亚健康状态[4-5]，经临床验证安全、有效。

温阳扶正散的化学成分较复杂，其中含有的挥发油，通过对表皮的刺激，形成穴位刺激发挥类针灸疗效。该调理方中包含多种挥发性成分，主要被报道的有抑制肠道内异常发酵[6-8]；扩张血管、促进人体内血液循环、降低血压、缓解肢体疼痛[9-12]；解热、镇痛、抗炎[13-14]；抗血栓及抑制血小板聚集[15-17]等多方面的作用。同时该复方含有的某些挥发性成分还具有一定的促透皮吸收功能[18-19]。临床研究表明，该方对阳虚质和痰湿质患者具有显著疗效。为保障本方调理亚健康状态临床疗效的稳定性，需对不同批次的复方进行质量控制研究。本文采用气相色谱法（gas chromatography，GC）对温阳扶正散的主要作用成分，即其挥发性成分进行指纹图谱研究，基于指纹图谱模式，采用气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）对桉油精、α-石竹烯、桂皮醛、丁香酚4 种成分进行了识别和对应，为本方的质量评价提供理论依据。

1 仪器与试药

1.1 药物与试剂

α-石竹烯对照品（批号：PS1174-0100，成都普思生物科技有限公司）、丁香酚对照品（批号：110725-201917，中国食品药品检定研究院）、桂皮醛对照品（批号：110710-202022，中国食品药品检定研究院）、桉油精对照品（批号：110788-201707，中国食品药品检定研究院）；无水硫酸钠、甲醇、无水乙醇均为分析纯；高纯度氮气（≥99.999%）（武汉市同和气体制造有限公司）、高纯氦气（≥99.999%）（武汉华星工业技术有限公司）；本实验所用温阳扶正散制剂均由湖北省中医院制剂中心制备。

1.2 仪器

Agilent 7890B-5977B 气相色谱-质谱联用仪[配有电子轰击离子源[（electron impact ion source，EI）；7697A顶空进样器，G4513A 自动进样器]；PerKElmer Clarus 580 气相色谱仪（美国PerKElmer 公司）；SPH-300 型氢气发生器（北京中惠普分析技术研究所）；CA-2 型静音无油空气泵（武汉科林普丰仪器有限公司）；Elite-WAX ETR（max 250℃，0.25 μm×0.25 mm×30 m）毛细管色谱柱；中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012A 科研类国家药典委员会）；真空机械泵（德国Pfeiffer Vacuum 公司）；NIST17 质谱数据库；Agilent Masshunter Qualitative Analysis 定性工作站。

2 方法与结果

2.1 GC 及GC-MS 条件

GC 条件：采用高纯度氮气（≥99.999%）为载气，载气流量为1.0 ml/min，进样量为1.0 μl，进样口温度为200℃，分流比为20∶1；FID 检测器温度为280℃，氢空比为45∶450 ml/min；升温程序设置为初始温度50℃，保持时间1 min；以10℃/min 的升温速率升温至180℃，保持时间3 min；再以10℃/min 的升温速率升温至240℃，保持时间5 min。

GC-MS 条件：EI 源，轰击电压70 eV，正离子模式，离子源温度为230℃，四级杆温度为170℃，接口温度为220℃，MS 扫描范围为m/z 30～500 amu。数据采集模式为全扫描。

2.2 挥发油的提取与得油率测定

本质量控制研究只针对本方挥发性成分，因而只进行挥发油的提取。选取湖北省中医院制剂中心不同批次生产的10 批代表性方剂，各称取约40 g，按照2020版《中华人民共和国药典》[20]第四部通则2204 中挥发油测定法甲法提取，各批次信息及挥发油得率见表1。

表1 本复方挥发油得率

2.3 供试品溶液及对照品溶液的配置

分别精密量取“2.2”项下所得挥发油0.20 ml，加入无水乙醇稀释10 倍，0.45 μm 有机滤膜滤过即得供试品溶液；分别精密量取α-石竹烯对照品10 μl、丁香酚对照品80 μl、桂皮醛对照品10 μl、桉油精对照品5 μl，置于2 ml 棕色容量瓶中，加入无水乙醇定容稀释，0.45 μm 有机滤膜滤过即得对照品溶液。

2.4 数据处理

采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件对得到的挥发性成分气相色谱图谱进行后续处理与分析，建立本质量控制研究的模型。

2.5 方法学研究

2.5.1 精密度试验 取1 号供试品溶液连续进样6 次，记录指纹图谱。测定各共有峰的保留时间和峰面积，计算相对保留时间和相对峰面积的相对标准差（relative standard deviation，RSD）值，RSD 值分别处于0.05%～0.45%和0.05%～2.70%，均＜3%。

2.5.2 重复性试验 取1 号样品，按“2.3”项下供试品溶液的配置方法再平行配置6 份供试品溶液，分别进样，记录指纹图谱。测定各共有峰的保留时间和峰面积，计算相对保留时间和相对峰面积的RSD 值，RSD值分别处于0.05%～0.64%和1.24%～2.82%，均＜3%。

2.5.3 稳定性试验 取1 号供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h 各进样1 次，记录指纹图谱。测定各共有峰的保留时间和峰面积，计算相对保留时间和相对峰面积的RSD 值，RSD 值分别处于0.05%～0.52%和0.05%～2.80%，均＜3%。

2.6 结果

2.6.1 基于气相色谱指纹图谱的质量控制模型的建立为控制温阳扶正散的质量，保障临床疗效稳定，将各批次所得挥发油的气相色谱图，导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，设定1 号样品为参照图谱，得到10 批温阳扶正散气相色谱指纹图谱叠加图（图1）和共有模式对照图谱（图2），识别出12 个主要色谱峰作为共有峰，其中2 号峰为桉油精、5 号峰为α-石竹烯、10 号峰为桂皮醛、11 号峰为丁香酚（图3），这几种挥发性成分在本方中具有明确疗效。同时计算出10 批温阳扶正散气相色谱指纹图谱相似度，S1 至S10 的相似度数据见表2。因丁香酚对照品在气相色谱图中的分离较好，且含量较高，故在指纹图谱评价系统中将其作为内参峰。

表2 10 批温阳扶正散气相指纹图谱相似度

图1 10 批温阳扶正散挥发油气相色谱叠加图谱

图2 10 批温阳扶正散挥发油气相共有图谱

图3 混合对照品图谱

2.6.2 气质定性结果 按照“2.3”项下方法，制备供试品溶液，用正己烷稀释100 倍后，按“2.1”项下GC-MS 条件进样分析，针对共有模式下12 个共有峰，经MS 库对照分析，结合文献进行识别[21-24]，结果见表3。

表3 共有峰化合物信息

3 讨论

基于温阳扶正散中挥发性成分与临床疗效有着直接关联，本研究创新性的采用指纹图谱和成分识别的研究模式，探讨了其质量稳定性。为了得到最佳气相色谱图，本研究参考了不同的程序升温条件[21-24]，观察每个样品色谱图中主要色谱峰的情况，尤为关注各峰之间的分离度，经过多次尝试和筛选，最终得到本研究中的程序升温色谱条件。本研究通过GC-MS 分析技术，NIST17 质谱数据库结合文献检索识别出12 种化合物，其中丁香酚为本实验测得温阳扶正散挥发油中含量最高的成分，在各批次中保持稳定占比，在质量控制模型中可作为参照峰，其余共有峰从含量占比上看，均与指纹图谱结果吻合，即含量高的峰对应指纹图谱上的峰高相对较高，同类型的质控指标含包括α-石竹烯、桂皮醛等。含量占比较低的峰在批次间波动较大，无法作为质量控制参数。

本实验结合GC-MS 分析技术进行定性研究，不仅揭示了共有峰所代表化合物的本质，也进一步揭示了本方物质基础，有利于充分对各指标进行评价。而以往指纹图谱研究在建立共有模式的基础上未进行定性研究，多未将共有峰与化合物相关联[25-27]。中药指纹图谱技术能全面反映整体内在化学特征，适用于评价复杂因素导致的各化学组分差异。由于制剂中心的原辅料供货单位、人员、生产季节等随着批次的不同不断变化，不同批次的方剂存在综合因素导致的质和量的改变，需要建立质控模型整体进行评价。物质基础质和量的变化会直接影响临床疗效，质控模型的建立对保证临床疗效有着重大意义。在本研究中，10 号样品与其他样品相比相似度较小，根据指纹图谱，10 号样品中月桂烯、桉油精、α-蒎烯、α-律草烯四种成分含量差异与其他样品相比较大，综合批号信息，考虑样品是在冬季制备，药材粉碎后，分子量较小的挥发性物质受温度影响不易溢出所致。提示临床用药时，可能会出现在冬季用药类针灸效果不佳的现象。建议在冬季对药粉稍加热后使用。