SCNN1A 多态性及其编码蛋白表达与子痫前期的相关性分析

隋 霜 冯国惠 黄 莺 李小英

新疆维吾尔自治区人民医院产科，新疆乌鲁木齐 830001

子痫前期，特别是早发型子痫前期是妊娠期高血压疾病较为严重的一个发展阶段，是导致孕产妇和围生儿死亡的主要原因[1-2]。上皮细胞钠离子通道（epithelial Na+channel，ENaC）是远侧肾单位顶膜调节离子的重要通道[3]，由α、β、γ 和δ 4 个亚基组成，ENaC的α 亚单位（α-ENaC）由SCNN1A 基因编码，是原发性高血压的重要候选基因，并且具有民族特质性[4-8]。慢性高血压与子痫前期，特别是早发型子痫前期有高度的关联性[9]。有研究发现，ENaC 可能参与子痫前期发生的调控机制[3]。故本研究通过检测SCNN1A 基因最长外显子多态性位点T663A 与子痫前期发病的相关性，并进一步检测子痫前期不同发病时限孕妇的α-ENaC mRNA 和蛋白表达水平，探讨SCNN1A 多态性及其编码蛋白表达在维吾尔族子痫前期不同发病时限孕妇中的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2017 年1 月至2019 年12 月新疆维吾尔自治区人民医院（以下简称“我院”）分娩或终止妊娠的122 例维吾尔族子痫前期孕妇为病例组，其中平均年龄（32.00±5.60）岁；平均孕次（1.53±0.46）次；平均尿蛋白含量（3.54±1.03）g/L。病例组按发病时限分为早发型子痫前期组（发病孕龄＜34 周，50 例）、晚发型子痫前期组（发病孕龄≥34 周，72 例）。疾病诊断标准：参照《妊娠期高血压疾病诊治指南（2020）》[10]关于子痫前期的诊断。并按年龄、孕次与病例组进行匹配，收集同期在我院定期产检并足月分娩的125 名正常孕妇为对照组，排除双胎及以上妊娠，伴有心脏、呼吸、内分泌、肾脏和肝脏、自身免疫等慢性疾病者。收集两组胎盘组织用于后续试验。

1.2 检测方法

1.2.1 胎盘组织中DNA 的提取 参照组织基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司，DP304]步骤提取胎盘组织基因组。

1.2.2 胎盘组织总RNA 的制备 采用TRIzol 法提取组织总RNA，保存于超低温冰箱。

1.2.3 一代测序检测SCNN1A 13 号外显子多态性位点 根据SCNN1A 基因信息，利用Primer Premier 5软件设计引物，经过测序PCR 反应、产物纯化、上机测序，将下机数据用sequence analysis 软件进行分析获得测序原始文件（峰图文件）。

1.2.4 real-time PCR 检测胎盘组织中α-ENaC mRNA水平 通过预实验优化条件，使用Fermentas 试剂盒合成cDNA，对胎盘组织的cDNA 模板进行PCR 扩增，SCNN1A 基因的引物信息见表1，real-time PCR 反应条件：热启动95℃，2 min；变性反应95℃5 s；退火延伸60℃10 s，94℃90 s，变性反应40 个循环；60℃1 min，60℃→94℃，1.1℃/s 升温；总反应体积10 μl：2×SYBR Green PCR Master Mix 5 μl，Primer F 0.25 μl，Primer R 0.25 μl，RNase free water 3.5 μl，cDNA 模板1 μl；相对表达量的计算采用2-ΔΔCt法。

表1 引物信息

1.2.5 Western blot 检测胎盘组织中SCNN1A 编码α-ENaC 蛋白水平 提取各胎盘组织中总蛋白，检测标本蛋白浓度，然后取50 g 蛋白上样，Western blot 分别检测胎盘组织中α-ENaC 蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0 软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料用例数表示，组间比较采用χ2检验；α-ENaC 蛋白表达水平与肾功能指标的相关性采用Pearson 相关性分析；Hardy-Weinberg 定律检验基因位点是否符合遗传平衡定律。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SCNN1A 基因13 号外显子突变结果

图1 表示SCNN1A 基因13 号外显子的6 个突变位点，其对应的基因位置和氨基酸名称见表2。

表2 SCNN1A 基因13 号外显子突变位置及其对应基因组位置和名称

图1 SCNN1A 基因13 号外显子6 个突变位点

2.2 两组多态性位点基因类型比较

两组SCNN1A 基因13 号外显子6 个突变位点中只存在一个多态性位点—T663A，并且通过Hardy-Weinberg 检验（P >0.05），属于遗传平衡群体，具有一定的人群代表性。两组T663A 多态性位点基因类型比较，差异无统计学意义（P >0.05）。见表3。

表3 两组T663A 多态性位点基因类型比较（例）

2.3 各组T663A 多态性位点基因型及等位基因比较

各组均通过Hardy-Weinberg 检验（P >0.05），属于遗传平衡群体，具有一定的人群代表性。各组T663A多态性位点基因型及等位基因比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表4。

表4 各组T663A 多态性位点基因型及等位基因比较（例）

2.4 不同T663A 多态性位点基因型α-ENaC 蛋白表达水平比较

不同T663A 多态性位点基因型α-ENaC 蛋白表达水平比较，差异无统计学意义（P >0.05）。见表5。

表5 不同T663A 多态性位点基因型α-ENaC 蛋白表达水平比较（）

表5 不同T663A 多态性位点基因型α-ENaC 蛋白表达水平比较（）

2.5 各组α-ENaC mRNA 及蛋白比较

各组α-ENaC mRNA、蛋白比较，差异无统计学意义（P >0.05）。见图2、表6。

图2 各组α-ENaC 蛋白表达

表6 各组α-ENaC mRNA 及蛋白比较（）

表6 各组α-ENaC mRNA 及蛋白比较（）

2.6 α-ENaC 蛋白表达水平与肾功能指标的相关性分析

α-ENaC 蛋白相对表达量与尿蛋白呈负相关（r=-0.846，P=0.034）。

3 讨论

子痫前期的发病机制尚不清楚，目前研究发现多个基因参与子痫前期的发病过程[11-14]。ENaC 参与调控上皮细胞Na+的吸收过程，包括水-盐平衡和其他很多生理过程，包括血压调节等[15]。妊娠期间收缩压无明显变化，舒张压轻度降低，α-ENaC 会根据孕期血压变化发生适应性变化[16]。有研究显示，孕激素可以影响蟾卵母细胞中ENaC 表达水平，导致其表达水平降低[3]。故本研究通过α-ENaC 编码基因SCNN1A最长外显子的多态性，探讨ENaC α 亚基在维吾尔族子痫前期不同发病时限孕妇中的作用。

SCNN1A 基因位于12 号染色体，编码ENaC α 亚基。目前国内外多项研究发现，SCNN1A 基因多态性与血压相关性疾病有关。由ENaC 突变导致的Liddle综合征高血压是钠依赖性常染色体显性高血压[17]；T663A 多态性不是新疆哈萨克族原发性高血压的危险因素[4,18]；有学者对α-ENaC T663A 多态性与高血压风险之间的关系进行了荟萃分析显示α-ENaC T663A多态性可能不是基本高血压的危险因素[17]。本研究结果显示，SCNN1A T663A 多态性在子痫前期不同发病时限的分布比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。提示SCNN1A T663A 多态性在子痫前期中的作用，与原发性高血压相似[19]。

本研究结果显示，各组α-ENaC mRNA、蛋白比较，差异无统计学意义（P >0.05）。与相关研究[18,20-21]结果一致。动物实验表明，妊娠期小鼠肾组织ENaC α 亚基过表达，会导致钠氯转运体表达下调，小鼠肾适应性障碍[18,21]。本研究结果显示，α-ENaC 蛋白相对表达量与尿蛋白定量呈负相关；结合患者α-ENaC 蛋白在妊娠期间参与肾脏水钠潴留和血浆容量的调节作用，α-ENaC 蛋白表达异常可能与孕期肾功能损害相关。研究发现，在子痫前期患者尿液中α-ENaC 表达量增加，碎片增加，ENaC 的活性增加，Na+再吸收增加，可能会增加子痫前期的风险[19]。国外研究发现，妊娠大鼠通过肾素（原）受体在调节肾内肾素-血管紧张素-醛固酮系统和α-ENaC 从而适应晚期妊娠大鼠的水钠潴留和血浆容量[22]。α-ENaC 适应性变化减弱，可能导致妊娠期血压升高。因此，α-ENaC 蛋白表达异常，导致肾脏适应性变化减弱，而增加子痫前期的风险[23]。