补肾生血药对化疗早期骨髓细胞的影响

巫 蓉 祝 微 王文娟 迟 莉 贾春蓉 岳竹君

1.首都医科大学中医药学院，北京 100069；2.首都医科大学附属北京天坛医院中医科，北京 100051；3.首都医科大学附属北京佑安医院病理科，北京 100069

化疗后骨髓抑制患者易出现感染、出血及贫血，不仅影响化疗进程，甚至威胁其生命[1-2]。因此，防治骨髓抑制是肿瘤治疗的重要内容。有研究表明，中医药在改善骨髓抑制方面优势明显[3]。既往研究中，中药干预结束时间多集中在环磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX）造模后1～2 周[4-6]，此时骨髓已进入恢复期。研究显示，CTX 化疗早期（化疗后5 d 内）外周血白细胞数明显下降，骨髓有核细胞数明显减少[7-8]。中药能否对化疗早期骨髓细胞产生影响，目前报道较少。补肾生血药为左归丸与当归补血汤合方，前期证实化疗后应用该药9～14 d 可明显促进骨髓细胞增殖，改善骨髓抑制[9-10]。本研究拟观察补肾生血药对化疗早期骨髓细胞的影响，以期为临床用药提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级雄性BALB/c 小鼠65 只，6～8 周龄，体重（20±2）g，由北京维通利华技术有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0006，使用许可证号：SYXK（京）2018-0003。本研究经首都医科大学实验动物伦理委员会批准（AEEI-2018-054）。

1.2 试剂与仪器

补肾生血药颗粒剂（北京康仁堂药业有限公司）；JAK 激酶2（JAK kinase 2，JAK2）、信号转导及转录激活因子5（signal transduction and activator of transcription 5，STAT5）、磷酸化STAT5（phosphorylated-STAT5，P-STAT5）兔抗小鼠抗体（美国CST，货号：0011、0004、0015）；β-actin 兔抗小鼠抗、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：TA-09、ZB-2301）；小鼠肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、γ 干扰素（interferon-γ，IFN-γ）酶联免疫吸附试验试剂盒（北京金海科隅生物科技发展有限公司，批号：20190901）；CTX（江苏盛迪医药有限公司，批号：18020825）；重组人粒细胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte colony stimulating factor，rhG-CSF）（厦门特宝生物工程股份有限公司，批号：201705B06）；RIPA 裂解液（北京普利莱基因技术有限公司，批号：201907258620）；Trizol（美国Invitrogen）；cDNA 第一链合成试剂盒（康为世纪，批号：CW2569）；SYBR FAST qPCR 试剂盒（美国KAPA Biosystems）。

1.3 研究方法

1.3.1 分组及干预 65 只小鼠按随机数字表法分为空白组、模型组、阳性对照组、补肾生血药高剂量组、补肾生血药低剂量组，每组13 只。预防给药5 d，补肾生血药高、低剂量组采用临床等效剂量的补肾生血药（47.0、23.5 g/kg）灌胃，其余组灌胃等量蒸馏水[10]。预防给药结束后，模型组、阳性对照组、补肾生血药高及低剂量组均腹腔注射环磷酰胺（100 mg/kg），空白组腹腔注射等量生理盐水，连续3 d[10]。同时进行干预用药，阳性对照组皮下注射rhG-CSF（30 μg/kg），其余组与预防给药阶段相同，连续5 d[10]。以外周血白细胞数降低为造模成功[11]。干预结束后，颈椎脱臼处死小鼠，收集骨髓细胞[7]。

1.3.2 骨髓细胞形态观察 取各组100 μl 骨髓细胞悬液（约1×107个细胞），除去上清液后用2.5%戊二醛固定，再经1%锇酸固定，制作超薄切片，透射电子显微镜下观察骨髓细胞超微结构。因透射电子显微镜样本观察批次及机器型号差异，不同组图片放大倍数稍有差异。

1.3.3 TNF-α、TGF-β、IFN-γ 含量检测 采用酶联免疫吸附试验检测，各组骨髓细胞悬液取上清，标准品孔中加入不同浓度标准品50 μl，样本孔中加入待测样本10 μl 及40 μl 稀释液；加入抗体100 μl，封闭并孵育1 h；重复洗涤5 次；加入底物A、B 各50 μl，避光孵育15 min 加入50 μl 终止液。采用酶标仪于450 nm 处测定OD 值。绘制标准曲线，计算样本中TNF-α、TGF-β、IFN-γ 含量。

1.3.4 JAK2、STAT5 的mRNA 表达情况检测 取各组骨髓细胞悬液1 ml，除去上清液后加入Trizol 吹打混匀。按试剂盒说明书操作，提取总RNA，测定RNA 浓度及纯度，反转录成cDNA，进行实时荧光定量PCR，反应体系共20 μl，条件：95℃预变性10 min，95℃变性10 s、59℃退火延伸60 s，共45 个循环。引物序列见表1。β-actin 为内参，采用2-ΔΔCT法分析JAK2、STAT5 的mRNA 表达情况。

表1 引物序列

1.3.5 JAK2、STAT5 及P-STAT5 蛋白表达情况检测采用蛋白质印迹法，取各组骨髓细胞悬液1 ml，除去上清液加入RIPA 裂解液（含蛋白磷酸酶抑制剂）混匀，离心提取总蛋白，测定蛋白浓度。将样品加热变性，每孔上样量30 μg，依次进行聚丙烯酰氨凝胶电泳、转膜、封闭、一抗（β-actin 1∶5000，JAK2、STAT5、PSTAT5 均1∶1000）和二抗（IgG 1∶5000）孵育、显影、曝光。β-actin 为内参，采用Image J 软件分析JAK2、STAT5及P-STAT5 蛋白表达。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，比较采用t 检验；多组计量资料比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 五组骨髓细胞超微结构

空白组骨髓有核细胞分布密集，核膜、胞膜完整，细胞器结构清晰。模型组有核细胞稀少，见大量细胞碎片，其余各组有核细胞数不同程度增多，胞体减小，细胞器尚好。见图1。

图1 五组骨髓细胞超微结构

2.2 五组骨髓细胞TNF-α、TGF-β、IFN-γ 含量比较

模型组TNF-α、TGF-β、IFN-γ 含量高于空白组，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。补肾生血药高、低剂量组TNF-α、TGF-β、IFN-γ 含量低于模型组，补肾生血药高剂量组TGF-β、IFN-γ 含量低于补肾生血药低剂量组，差异有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）。见图2。

图2 五组骨髓细胞TNF-α、TGF-β、IFN-γ 含量比较

2.3 五组骨髓细胞JAK2、STAT5 的mRNA 表达水平比较

与空白组比较，模型组JAK2、STAT5 mRNA 表达下调；与模型组比较，补肾生血药高、低剂量组STAT5 mRNA 表达上调；与补肾生血药低剂量组比较，补肾生血药高剂量组JAK2 mRNA 表达下调，差异均有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）。见图3。

图3 五组骨髓细胞JAK2、STAT5 的mRNA 表达比较

2.4 五组骨髓细胞JAK2、P-STAT5、STAT5 蛋白表达水平比较

模型组JAK2、P-STAT5、STAT5 蛋白表达水平低于空白组，补肾生血药高、低剂量组JAK2、P-STAT5蛋白表达水平高于模型组，补肾生血药高剂量组P-STAT5 蛋白表达水平低于补肾生血药低剂量组，差异均有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）。见图4～5。

图4 五组骨髓细胞JAK2、P-STAT5、STAT5 蛋白条带图

3 讨论

TNF-α、TGF-β、IFN-γ 为造血负调控因子，能通过多途径抑制骨髓造血，加速造血细胞凋亡[12-15]。TNF-α 直接抑制骨髓细胞分裂，诱导其凋亡；TGF-β 可于G1期阻断造血干细胞（hemopoietic stem cell，HSCs），抑制其增殖分化，诱导其凋亡；IFN-γ 与HSCs 受体结合，可抑制HSCs 自我更新和增殖。研究报道，化疗药可促进TNF-α、IFN-γ、TGF-β 分泌，抑制造血细胞增殖分化[16-17]，与本研究结果一致。JAK2-STAT5 通路能介导多种造血因子的信号转导，参与造血细胞增殖、分化、凋亡，在骨髓造血、免疫调节方面发挥着重要作用[18-19]。JAK2 与红细胞生成相关；STAT5 活化后具有促细胞增生、抑制凋亡的作用。有研究报道，CTX 可下调骨髓细胞JAK2、STAT5 蛋白表达[20]。本研究结果显示，CTX 可下调JAK2、STAT5 mRNA 表达，提示化疗后JAK2-STAT5 通路抑制明显。本研究结果显示，补肾生血药能减轻骨髓细胞结构损伤，降低骨髓中造血负调控因子含量，上调JAK2-STAT5 通路分子表达，提示补肾生血药能减轻化疗早期骨髓细胞损伤，机制与降低造血负调控因子含量，正调控JAK2-STAT5 通路相关。

图5 五组骨髓细胞JAK2、P-STAT5、STAT5 蛋白表达比较（n=13）