一株产纤维素酶细菌B4的鉴定及发酵条件优化

杨艳红，刘 旸，张浩铂，姚心怡，贺 禧

(1.重庆理工大学 药学与生物工程学院， 重庆 400054； 2.重庆市育才中学, 重庆 400050)

0 引言

纤维素生物质是地球上分布最广泛、含量最丰富的碳水化合物，约占全球总可用生物量的50%，主要由纤维素(30%～50%)、半纤维素 (20%～30%)、木质素(15%～30%)组成[1-3]。但纤维素、半纤维素和木质素是紧密结合的、通过氢与共价键的复接，使其成为顽固性的生物质结构，所以纤维素生物质也是应用效率最低的一种自然物质[4-5]，在实际应用中，仅开发了不到2%的纤维素资源[6]。随着人类世界迅猛发展，能源需求量急剧上升，为实现可持续发展，世界各国均在努力寻求新的替代能源，如风能、核能、太阳能、生物质能等。在各种新型的替代能源中，纤维素燃料乙醇是公认的最具有发展前景的可再生能源。利用现代生物技术将纤维素转化为乙醇等液体燃料，产量稳定、可再生、无污染，有希望解决能源危机、环境污染和粮食危机等问题[7]。虽然科学家们现在已经做了大量的木质纤维素的转化研究，但是由于半纤维素酶和纤维素酶的成本问题，把纤维素生物质转化成生物乙醇仍面临巨大挑战[8]。目前，生物燃料乙醇生产高度依赖于商业生产的酶，成本非常高[9-10]。因此，开发新型、高效、低成本的纤维素酶迫在眉睫，选育纤维素酶高产菌株尤其重要[11-12]。本课题组从重庆市周边堆肥中筛选出一株纤维素酶高产细菌菌株，对其进行鉴定和发酵条件研究，可为纤维素酶制剂研究提供菌株来源和为遗传改良、基因工程菌株的构建等工作提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1菌株

B4 ，重庆理工大学生物工程实验室分离。

1.1.2试剂

葡萄糖、3，5-二硝基水杨酸等常规试剂均为国产分析纯；溶菌酶、细菌基因组总DNA 提取试剂盒、细菌鉴定试剂盒、PCR 产物回收试剂盒均购于北京擎科生物科技有限公司成都分公司。

1.1.3培养基

肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.3 g，蛋白胨1.0 g，NaCl 0.5 g，水100 mL，pH 7.0。

菌种鉴定培养基：参见《常见细菌系统鉴定手册》[7]。

固体发酵培养基：(NH4)2SO40.5 g，蛋白胨0.5 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.075 g，糖蜜0.5 g，CaCl20.5 g，NaCl 0.5 g，纤维素粉20 g，麸皮30 g，水125 mL。

1.2 方法

1.2.1菌株形态及菌落形态观察

将B4菌株划线接种于牛肉膏蛋白胨培养基平板，30 ℃下培养1～2 d，观察菌落形态。挑取菌落抹片，然后分别进行革兰氏染色、芽孢染色、荚膜染色和鞭毛染色，镜检，观察分离菌株菌体形态与其他特征。

1.2.2生理生化特征和生理耐受特性

参照文献《常见细菌系统鉴定手册》[13]和《现代微生物学实验技术》[14]进行。

1.2.316S rDNA序列测定

把B4菌株培养至对数期，严格按照植物 DNA 提取试剂盒(通用型)操作说明进行操作，获得基因组DNA，提取的 DNA 样品适量稀释后作为 PCR 模板，以擎科 1×TSE101 金牌 mix 进行PCR反应，PCR产物用擎科DNA 凝胶回收试剂盒进行回收纯化。纯化产物送北京擎科生物科技有限公司成都分公司测序部进行全序列测序。将序列通过NCBI网站中的BLAST程序与GenBank中的核酸数据进行对比分析。根据比对结果，从数据库中选取与所分析的细菌基因序列同源性较高的已知相关序列，采用MEGA 11.0软件进行多重序列比对分析，用邻接法(neighbor-joining，NJ)构建系统发育树，用Bootstrap检验，Bootstrap值为1 000。

1.2.4发酵培养基筛选

1) 酶活力定义：以滤纸为底物，在一定反应条件(pH 5.6，50 ℃，恒温30 min)下，以水解反应中，1 g发酵固体产生的纤维素酶1 min催化纤维素生成1 μg葡萄糖为1个滤纸酶活单位，以U表示。

2) 滤纸酶活力测定方法：采用DNS法[14]。

3) 先采用单因素预实验确定最佳纤维素粉为玉米芯粉，最佳迟效氮源蛋白胨和麸皮。在初筛的基础上对培养基的主要成分进行13因素3水平的正交实验优选，固体发酵培养从第1 d开始取样，直到测定滤纸酶活下降为止，以最高滤纸酶活为指标进行统计分析，因素水平排布见表1。

表1 培养基成分正交设计因素水平排布

1.2.5理化因素发酵条件筛选

先经单因素预实验分别确定初步的发酵条件为pH 6.5，温度35 ℃。然后以pH、温度和接种量为考察因素进一步正交优化，固体发酵培养从第1 d开始取样，直到测定滤纸酶活下降为止，以最高滤纸酶活为指标进行统计分析，正交实验因素水平排布见表2。

表2 理化条件筛选因素水平排布

2 结果与分析

2.1 菌落形态及个体形态

B4菌株菌落均呈圆形，乳白色，表面干燥，中心隆起，边缘不规则，呈锯齿状。菌体革兰氏染色为阳性，长杆状，芽孢椭圆中生，形态特征见图1。

图1 B4菌株形态特征示意图

2.2 生理生化特征和生理耐受特性

B4菌的生理生化试验结果见表3：除了运动性、V-P、吲哚试验呈阴性外，其余的甲基红、纤维素水解、淀粉水解、硝酸盐还原、尿素分解、过氧化氢酶、明胶液化试验均呈阳性；糖类利用试验结果表明B4菌对测试9种糖均可利用，对于五碳糖阿拉伯糖的利用效果最好，其次是葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的利用效果好。生理耐受特性试验结果见表4， B4菌能在25～45 ℃生长，25～37 ℃生长较旺盛，最适的生长温度为25 ℃；B4菌耐受NaCl最大浓度为8%；能在pH为5.0～8.0生长，最适pH值为8.0。综合供试菌株B4的形态特征及生理生化特性及生理耐受特性，《常见细菌系统鉴定手册》中相应属、种的有关性状，可将B4菌归入芽孢杆菌属(Bacillus)。

表3 菌株B4生理生化特征

表4 B4菌的生理耐受性特性

续表(表4)

2.3 16S rDNA 序列和系统发育分析

B4的16S rDNA的基因全序列长度为1 449 bp，在GenBank中的登录号为：OM755768。将获得的基因序列在GenBank数据库中进行Blast同源性比对分析，结果表明，B4的16S rDNA序列与许多Bacillusamyloliquefaciens相似性均为99.5%以上。从中选取部分同源性较高的菌种，用MEGA11.0构建的系统发育树分析，如图2所示，发现B4与BacillusamyloliquefaciensstrainW9和SXAU001聚在一个进化分支上。

综合上述B4菌株的形态、生理生化特征，以及16S rDNA的系统发育树的分析，确定B4菌株为芽孢杆菌属的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

注：步长值为1 000 ，节点上的频率大于50的保留，括号中的数字表示序列在GenBank中的登录号， 0.5%为遗传标尺

2.4 固体发酵培养基筛选

培养基筛选的正交试验结果如表5所示。由极差值R可以得出各因素对菌株B4产酶活力的影响程度由大到小依次为：玉米芯粉> MgSO4·7H2O>CaCl2>土温20>麸皮>蛋白胨>(NH4)2SO4>NaCl>水>土温80。由正交分析可得出B4菌的固体发酵培养基的最佳配比为：通过直观分析得出综合的优方案为：玉米芯粉 25 g、七水硫酸镁 0.075 g、氯化钙 0.2 g、土温20 0.4 g、麸皮 8 g、蛋白胨 0.5 g、硫酸铵 0.2 g、氯化钠 0.2 g、水 120 mL、土温80 0.2 g、磷酸二氢钾 0.5 g、糖蜜 0.5 g。

表5 发酵培养基成分正交实验结果

续表(表5)

根据表6方差分析进行因素显著性判断，可见玉米芯粉和七水硫酸镁对滤纸酶活有非常显著的影响，氯化钙和土温20对滤纸酶活有显著影响。而七水硫酸镁的优化结果正好处于中间水平值，不需再筛选。又因玉米芯粉、氯化钙及土温20在正交优化结果中处于边缘水平值，因此，在保持其他成分按正交优化的结果外，玉米芯粉、氯化钙及土温20这3个因素需要另设水平进行4因素3水平正交优化，正交排布表和结果分别见表7、8。

表6 发酵培养基成分正交实验方差分析

续表(表6)

表7 培养基成分复筛正交排布

通过复筛结果表8可以得出综合的优方案为：玉米芯粉 25 g、七水硫酸镁 0.075 g、氯化钙 0.1 g。综合第1次正交优化结果，最终确定B4发酵纤维素酶的最佳固体发酵培养基为：玉米芯粉 25 g、七水硫酸镁 0.1 g、氯化钙 0.1 g、土温20 0.6 g、麸皮 8 g、蛋白胨 0.5 g、硫酸铵 0.2 g、氯化钠 0.6 g、土温80 0.2 g、磷酸二氢钾 0.5 g、糖蜜0.5 g、水 125 mL。

表8 培养基成分复筛试验结果

2.5 理化因素发酵筛选

发酵理化条件筛选采用正交试验，结果见表9，由极差值R可以得出各因素对产酶活力影响由大到小依次为：温度>pH>接种量。同时，正交分析得出B4菌的固体发酵条件为：温度34 °C，pH 6.0，接种量1.5%(OD600=1.0)。

表9 理化条件筛选结果

B4菌在上述确定的最佳培养基和最佳理化条件下进行发酵，取不同发酵时间的样品进行滤纸酶活测定，做出发酵时间和酶活的变化曲线，确定最佳发酵时间，结果如图3所示，在前12 h内滤纸酶活随着发酵时间呈直线上升，12～24 h，滤纸酶活增加缓慢，直到24 h到达18.74 U/g，24 h以后，滤纸酶活迅速下降。

图3 酶活随发酵时间的变化曲线

3 讨论

纤维素酶(cellulose)是降解纤维素生成单糖或多糖的一组酶的总称。纤维素酶由多组复合酶系组成，主要包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-1、4葡萄糖苷酶， 3种酶相互协同降解纤维素物质[15]。滤纸是聚合度和结晶度都居“中等”的纤维性材料，以其为底物经纤维素酶水解后生成还原糖的量来表征纤维素酶系总的糖化能力的方法得到广泛应用，它反映了三类酶组分的协同作用，统称滤纸酶活，滤纸酶活力可代表纤维素酶的总体酶活力，即纤维素内切酶水解纤维素聚合链，将其还原性和非还原性末端暴露在外；外切葡聚糖酶则作用于这些末端，释放纤维二糖或纤维寡糖；β-葡聚糖苷酶的作用则是水解纤维二糖，3个酶组分相互协同作用，释放最终的水解产物葡萄糖[16-17]。本文在筛选B4菌株固体发酵条件时以滤纸酶活为测定指标，该指标是菌株B4整个纤维素酶系的酶活力水平的综合体现，代表了纤维素酶的3种酶组分协同作用后的总酶活。以该指标筛选出来的发酵条件对菌株的实际开发应用更有参考价值。

目前对纤维素酶产生菌的研究主要集中在真菌，如木霉属、青霉属和曲霉属等，而其纤维素酶多数结合在细胞膜上，菌体细胞需吸附在纤维素上才能起作用，使用很不方便，且酶的分离提取成本太高[18]，并且这些真菌生产纤维素酶不仅生产周期长，产生的纤维素酶大多需要在较高温度条件下才能发挥较好的效能，在室温或较低温度下，它们的酶活力都非常低。而细菌产生的纤维素酶以多酶复合体的形式存在，能够更加彻底、更加有效地降解纤维素[19]。近 20 年来，随着中性纤维素酶和碱性纤维素酶在棉纺织品的水洗工艺和洗涤剂中的成功应用，细菌纤维素酶的酶制剂也显示出良好的应用前景[20]。

4 结论

本文筛选的B4菌株是一种解淀粉芽孢杆菌，是一种与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的细菌，在自然界分布广泛，易分离培养，对人畜无毒无害，不污染环境，具有很好的应用前景。另外，该菌株最适生长温度为25 ℃，在筛选的最适培养基和最适条件下，固体发酵24 h就能获得较高滤纸酶活力，相对于普通真菌产酶周期一般几天至一个月来说，发酵周期大大缩短，并且酶系组分较全，具有很好的开发潜力。