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机油降解真菌的筛选及降解效果的研究

2022-06-18吴燕红高焕方

关键词:活性剂机油菌株

吴燕红,李 聪,石 冀,高焕方

(1.重庆理工大学 化学化工学院, 重庆 400054; 2.重庆汇亚环保工程有限公司, 重庆 400041)

0 引言

机油作为从石油中提炼出来的一种产品,在工业及日常生活中被广泛使用,在生产、运输、使用过程中的跑冒滴漏及突发性泄漏事故,含油污水的随意排放等都对水资源造成了极大的污染[1-2]。机油主要是以多种复杂的碳氢化合物为主要成分的混合物,其中芳香烃对人的危害及毒性尤为突出[3],会产生致癌、致畸和致突变作用[4]。现有的石油烃污染修复技术主要有化学修复法、物理修复法和生物修复法[5],其中生物法利用降解菌转化机油中石油烃类化合物,以此达到修复机油污染场地的目的,此方法成本低、效果好且无二次污染[6-7]。

微生物降解石油烃过程复杂,有多种酶参与。石油中不同烃类化合物的代谢途径和机理是不同的[8]。已有许多研究证实真菌可作为石油烃降解菌[9],其对石油烃的降解能力受石油组分、微生物种类、环境参数等的影响[10-12]。郑金秀等[13]从污染土壤中分离到一株产生生物表面活性剂的菌株,与其他2株不产表面活性剂的菌株对比,能有效提高菌株对石油的降解效率,降解率最多可提高18.3%。目前,关于机油污染水体短时有效的修复技术,尤其对于加入表面活性剂作用的生物强化研究较少。

在筛选石油降解菌的基础上,探讨单一环境因素改变时,筛选出的真菌aspergillusversicolor降解机油的效果,并在此基础上进行生物强化,探索投加表面活性剂进行生物强化降解污染废水中机油的可行性。

1 实验部分

1.1 主要试剂及仪器

牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏5.0 g,蛋白胨10.0 g,氯化钠5.0 g,去离子水定容至1 L,pH=7.0。

牛肉膏蛋白胨平板:牛肉膏蛋白胨培养基中加入1.5%~2.0%的琼脂。

无机盐基础培养基(MSM):磷酸二氢钠8.5 g,磷酸二氢钾3.0 g,氯化钠4.0 g,氯化铵1.0 g,七水硫酸镁0.5 g,二水氯化钙0.02 g,三氯化铁0.02 g,一水硫酸锰0.004 g,七水硫酸锌0.004 g,硫酸铜0.000 4 g,去离子水定容至1 L。

降解机油液体培养基:无机盐基础培养基加入浓度为2 500 mg/L机油。

试剂:磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化铵、七水硫酸镁、二水氯化钙、三氯化铁、一水硫酸锰、七水硫酸锌、硫酸铜、无水硫酸钠、石油醚(60~90)、无水乙醇等均购自成都市科隆化学品有限公司;牛肉膏、蛋白胨购自北京奥博星生物技术有限责任公司、琼脂购自上海麦克林生化科技有限公司,以上试剂均为分析纯,40#机油(昆仑5w- 40)购自中国石油控股集团昆仑润滑油有限公司,SN级。

仪器:ABI3730XL基因测序仪(上海艾研生物科技有限公司)、高压蒸汽灭菌器-BIOBASE(山东博科生物产业有限公司)、Boxun博迅vs-840-2单人双面垂直净化工作台(苏州赛恩斯仪器有限公司)、SHP-100生化培养箱(上海精其仪器有限公司)、SHZ-82气浴摇床(江苏中和实验仪器制造有限公司)、UV756CRT紫外可见分光光度计(上海佑科仪器仪表有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1菌种的筛选及鉴定

筛选:菌株筛选于重庆某场地石油烃污染土壤,取污染土壤10 g于含油无机盐培养基中富集,后取其上清液在含无菌水试管中10-1、10-2、10-3、10- 4、10-5、10-6、10-7梯度稀释,各取1 μL稀释液在牛肉膏蛋白胨平板上进行涂布平板,后平板划线纯化出几株对机油具有降解效果的单菌株,比较其降解效果,筛选出的菌株为真菌aspergillusversicolor。

ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’引物对样品DNA进行扩增,采用Sanger法对PCR产物测序,PCR产物条带大小约为500~750 bp,采用双向引物测序,结果采用DNAMAN软件6.0进行拼接处理,在NCBI数据中的BlastBI进行序列比对。

1.2.2机油降解率的测定方法

水中机油的提取:把样品移入分液漏斗,量取10 mL的石油醚润洗锥形瓶,后倒入分液漏斗中,充分震荡3 min,期间需经常开启旋塞排气,静置至液液分层,将下层液体转移至烧杯中,重复上述步骤萃取3次,将萃取液体转移至同一个烧杯[14]。在烧杯中加入450 ℃、4 h烘干后的无水硫酸钠,补加至其呈流沙状,后过滤至25 mL容量瓶,经稀释后使用紫外可见分光光度计测定其吸光度。

紫外可见分光光度计标准曲线绘制:精确称取0.1 g的机油,配置成100 mg/L的标准溶液,稀释为浓度是5、10、20、30、40、50 mg/L的溶液,待测其吸光度,调节不同波长测同一标准液,以确定机油最佳吸收波长,波长为230 nm最佳,后以此波长测量不同浓度溶液吸光度,绘制标准曲线,结果如图1。

图1 不同浓度溶液吸光度曲线

式中:x1为空白样的浓度,x2为降解后的浓度。

1.2.3实验条件

实验样品为100 mL无机盐培养液中加入0.25 g机油,配置成浓度为2 500 mg/L的机油降解培养基,121 ℃、30 min灭菌处理进行后续实验,每个实验样品均做3次平行实验,取其平均值。所有数据绘图利用软件Origin 2018进行绘制。

1) pH对降解效果的影响:用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH分别将机油降解培养基调节pH至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0,盐度4 g/L,加菌5%,以30 ℃、160 r/min在气浴摇床中保持3 d,后测定其机油降解率。

2) 加菌量对降解效果的影响:将溶液调至pH=6.0,盐度4 g/L,分别加菌1%、3%、5%、7%、9%,以30 ℃、160 r/min在气浴摇床中保持3 d,后测定其机油降解率。

3) 盐度对降解效果的影响:溶液pH=6.0,在每个样品中分别加入NaCl为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g,加菌5%,以30 ℃、160 r/min在气浴摇床中保持3 d,后测定其机油降解率。

4) 降解天数对降解效果的影响:溶液pH=6.0,加菌5%,盐度3 g/L,以30 ℃、160 r/min,分别在气浴摇床中保持24、48、72、96、120、144 h时,取出一组样品测定其机油降解率。

5) 生物强化对降解效果的影响:选取生物表面活性剂槐糖脂、茶皂素,使用去离子水将其配置成100 g/L的溶液,分别在溶液pH=7.0,盐度3 g/L,机油降解培养基中加入0.9、1.2、1.5、1.8、2.1、2.4 mL的槐糖脂溶液,加菌5%,以30 ℃、160 r/min在气浴摇床中保持3 d,后测定其机油降解率。

2 结果与讨论

2.1 筛选出的机油降解菌ITS基因鉴定

实验筛选出的机油降解菌最初未经鉴定,将其暂时命名为WHY菌株,之后对其进行ITS基因测序,根据数据库比对,筛选出的WHY菌株与aspergillusversicolorisolateZF210相似度最高,去除首尾多余序列后同源性为99.12%。据ITS序列结果显示,WHY菌株为真菌aspergillusversicolor。机油降解菌WHY与亲缘相近菌株ITS序列系统发育树,如图2。

图2 机油降解菌与亲缘相近菌株ITS序列的系统发育树

2.2 环境因素对机油降解效果的影响

2.2.1pH的影响

图3为菌株在不同pH条件下对水中机油的降解效果。由图3可得,随着含油无机盐溶液中pH升高,菌株对机油的降解率呈上升趋势,在pH=6.0时达最高降解率35.9%,至pH增加为6.0后,降解率迅速下降,由此表明菌株在中性偏碱性的环境中降解效果较差,因此菌株适宜生长于中性偏酸性环境中生长,实验条件pH为6.0左右最佳。不同pH对机油降解效果的差异性是源于pH对菌株的生长及代谢有着重要的作用,影响菌株酶活性,细胞质的透性以及稳定性[15]。

图3 菌株在不同pH条件下对水中机油的降解效果

2.2.2加菌量的影响

测定不同加菌量对水中机油的降解效果,结果见图4。由图4可观察到,随菌液量增加,整体降解效果呈增长趋势,在7%时的降解率最高,可达36.7%,加菌量为9%时,降解率出现明显下降,在5%~7%的加菌量范围为最佳加菌量。由此可得,菌株加菌量的多少,与之能达到的降解率无正相关关系,这可能是在一定量的无机盐培养基中,过多的菌株会造成过度繁殖,形成一种竞争,导致营养物质短缺,从而减缓菌株的生长,甚至由于恶劣的生存环境,可能会使其产生一些抑制生长甚至死亡的产物,菌株存活率随之降低、死亡率增高。加菌量的多少会直接影响菌株的新陈代谢、生长速率、胞内酶活性、是否达到最佳生长状态,从而影响机油的降解率。

图4 不同加菌量对水中机油的降解效果

2.2.3盐度的影响

无机盐是菌株生长的重要营养物质,不同盐浓度对菌株降解机油的效果如图5所示。从图中可以看到,真菌aspergillusversicolor对钠盐的耐受能力比较强且对其降解效果影响较大,在盐浓度为3 g/L时,达到最好的降解效果,此时机油的降解率最高,为37.7%,当超过3 g/L时,降解率会随着盐浓度的升高而降低,这可能是当其超过盐度适应极限[16-17],过高的盐浓度会影响菌株的代谢活性,使之对机油的降解能力减弱。

2.2.4降解天数的影响

随着菌株在含油无机盐培养基中降解时间的增加,它对水中机油的降解效果如图6所示。从图6中可以明显看出,菌株对水中机油的降解速率随着降解时间延长迅速上升,到了144 h后,降解速率变缓,几乎与96 h的降解速率相近,此时能达到的最高降解速率在42.6%。这可能是由于菌株最初是以机油中的烷烃及小分子芳烃作为碳源,较易降解,随着时间增加,小分子组分被分解,菌株才开始降解多环芳烃、胶质、沥青质等较难降解的大分子组分,也可能是由于菌株对水中机油的分解,积累的有毒有害物质增多,造成了菌株的死亡,同时营养物质的缺失,也是造成其后期降解速率减缓的一个因素。探究降解时间对水中机油降解率的影响,有较大的经济价值,避免增加时间成本、资源成本增加微弱的降解作用。

图6 不同时间对水中机油的降解效果

2.3 生物强化对机油降解效果的影响

选用槐糖脂、茶皂素2种生物表面活性剂作为生物强化助剂,助剂的加入会显著提高菌株对机油的降解效果[18-19],强化后的降解率、机油剩余浓度见图7。在加入1.4 mL的茶皂素溶液时,此时菌株对机油降解率最高可达71.2%,这是因为添加表面活性剂,可以增强非极性底物的乳化和溶解作用,以帮助底物和养分向菌株细胞输送,促进其生长,同时促使机油形成微小颗粒,更容易在水溶液中分解[20],同时增加O2和微生物的接触,但是随着表面活性剂浓度的增高,它的降解率并没有随之增加,反而呈现了下降的趋势,这很有可能是由于表面活性剂的浓度超过临界胶束浓度(CMC)时,会对菌株表现出一种毒害作用,因此,在表面活性剂的使用中,找到CMC对研究尤为重要。

图7 槐糖脂、茶皂素浓度对机油降解效果的影响曲线

2.4 真菌好氧降解机油途径

图8反映了真菌好氧代谢降解石油烃中链烷烃、环烷烃、芳香烃的过程。真菌主要产生单加氧酶和细胞色素酶,以胞内酶参与反应[21]。在已有文献中,多采用GC-MS测定石油烃产物[22],在链烷烃时,通过直接脱氢(过程1)或加氧酶氧化(过程2),将其转化为脂肪酸,后经ß氧化(过程3)降解为乙酰辅酶A,由三羧酸循环(过程4)分解为CO2、H2O和能量;在环烷烃中,经混合功能氧化酶氧化(过程6)为环烷醇,再经过程1和过程2转化为内酯,或通过直接开环(过程5),与链烷烃转变为脂肪酸后途径相似;到芳香烃,单加氧酶/细胞色素酶(反应7)将芳烃中苯环烃基化,其后一个氧原子加到苯环上(过程8)形成环氧化合物,经水解(过程9)和苯环断裂(过程10)后形成各式酸类产物,最后分解为CO2和H2O等产物[23-24]。

图8 真菌好氧代谢降解石油烃途径示意图

3 结论

1) 从石油烃污染场地土壤中筛选出的菌株,同样适用于降解其他石油烃污染物,相较于大多数文献中利用细菌降解,真菌对水体中的机油同样具有较好的降解效果。

2) 多种环境因素都会对机油的降解效果产生较大影响,在接菌量5%、pH=6.0、盐度3 g/L时,4 d是最节省时间和成本的最优条件。

3) 使用生物表面活性剂对菌株进行生物强化,对降解效果有极大的影响,对于探究和开发其他的生物表面活性剂协助菌株降解石油烃类物质有重要意义。

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