基于还原石墨烯和硫堇-金纳米粒子复合物的电化学DNA生物传感器的制备

董 笑，时安琪，耿 明

（1淮北师范大学 信息学院，安徽 淮北 235000；2安徽师范大学 化学与材料科学学院，安徽 芜湖 241000）

0 引言

随着人类基因组计划研究的蓬勃发展，DNA 生物传感器在基因测序、分子诊断和癌症疾病早期诊断中发挥的作用也越来越大［1-3］.电化学DNA 生物传感器的构建一般是通过共价键合或者化学吸附作用，将敏感元件探针DNA 固定到电极表面，通过检测杂交过程产生的电化学信号来实现定量检测目标DNA，具有制备简单、操作方便、灵敏度高且稳定性好的优点.

石墨烯特殊结构使它具有优良电学、光学、力学和热学性质，已经作为一种良好的电化学传感材料，广泛用于传感器的制备中.目前很多课题组已经报道以石墨烯作为修饰电极的DNA生物传感器［4-9］.

本实验结合纳米金和石墨烯优点，制备一种以金纳米-石墨烯为传感界面的电化学三明治型DNA生物传感器.最佳实验条件下，该传感器拥有良好的分析性能及宽的线性响应范围（1.00×10-16mol·L-1~1.00×10-9mol·L-1）.该传感器有望用于实际样品的分析.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

硫堇（上海国药化学试剂有限公司）、还原石墨烯（rGO）（中科炭纳米科技有限公司）、氯金酸（HauCl4·4H2O）（上海化学试剂有限公司）、二烷基磺酸钠（SDS）（中国天津阿法埃莎化学有限公司）、牛血清白蛋白（BSA,96%-99%）（郑州博赛生物技术股份有限公司）、不同序列的DNA（上海生工生物工程技术服务有限公司中）.

CHI60C电化学工作站（上海辰华仪器公司）.

扫描电子显微镜（SEM）（日本日立公司，JEOLJSM-4800F）.

探针DNA序列：5′-SH-（CH2）6-AAA ACC CTC CTC AAC CCC CT-3′.

信使DNA序列：5′-CCT CTA TAC CAA TTT CCA AAA-（CH2）3-3′.

目标DNA序列：5′-TGG AAA TTG GTA TAG AGG AGG GGG TTG AGG AGG GT-3′.

单碱基错配序列：5′-TGG AAA TTG GTA TAG AGG AGG GGN TTG AGG AGG GT-3′（“N”代表碱基A，C或者T）.

完全不互补序列：5′-CAT GGC GGA AGC CGC TAC GTC CCC GGT CTA CAT TC-3′.

用pH7.4的0.01 mol·L-1磷酸缓冲溶液（PBS）配制不同序列的DNA，存于冰箱中待用.实验中DNA杂交时所用溶液为含有0.1 mol·L-1NaCl 的0.01 mol·L-1PBS（pH7.4），电化学检测液为0.10 mol·L-1PBS（pH7.4），实验用水均为重蒸水.

三电极系统：工作电极为玻碳电极或修饰电极（Φ=3 mm），参比电极为饱和甘汞电极（SCE），对电极为铂丝电极；

1.2 金纳米粒子的合成

金纳米粒子（Au NPs）的制备采用柠檬酸三钠还原氯金酸法，具体过程如下：将置于圆底烧瓶中的1 mL氯金酸原液（质量浓度为1 g·100 mL-1）与99 mL去离子水混合液体加热至沸腾，迅速将4 mL新配制的柠檬酸三钠（质量分数为1%）溶液加入至烧瓶中，全程保持搅拌，直至溶液颜色逐渐由紫色变为酒红色.约15 min后停止加热，将溶液冷却至室温，移至棕色广口瓶中存放，置于冰箱中待用.

1.3 信使DNA-硫堇-金纳米粒子复合物的制备

信使DNA-硫堇-金纳米粒子复合物（rDNA-Thi-Au NPs）是根据文献报道的内容稍加修改制备而成［10］.将300 μL的信使DNA（1.00×10-5mol·L-1）加入到1.7 mL浓缩后的Au NPs溶液中，保持摩尔比（信使DNA：Au NPs）为150.在冰箱里混合放置24 h后，通过金-硫键的作用信使DNA连接在Au NPs上.然后加入含有0.1 mol·L-1NaCl（pH 7.4）的0.01 mol·L-1PBS缓冲溶液使其“老化”12 h.接着，将200 μL硫堇（0.1 mmol·L-1）加入到上述溶液中，室温下低速搅拌24 h.最后，加入1.0 mL质量分数为1%的BSA溶液用以封闭活性位点.将制备好的复合物在16 000 r/min条件下离心10 min，将上层清液移除，用去离子水反复洗涤3次，最后分散在pH值为7.4的0.01 mol·L-1PBS缓冲溶液中（含0.1 mol·L-1NaCl）.

1.4 DNA生物传感器的组装

在制备修饰电极之前，需对玻碳电极进行预处理［11］.分别用不同粒度的α-Al2O3对裸玻碳电极抛光处理，然后分别在无水乙醇、丙酮和去离子水中超声5 min，最后在氮气气氛中吹干.

将0.5 mg·mL-1的还原石墨烯在乙醇溶液中进行超声，超声均匀后，滴涂5.0 μL到预处理后的电极表面，室温下晾干，在电极表面形成石墨烯薄膜（rGO）.将该电极置于1.0 mg·mL-1HAuCl4/0.10 moL·L-1NaNO3溶液中，-0.20 V条件下恒电位沉积20 s［12］，取出后用重蒸水冲洗3次，室温晾干，获得Au NPs-rGO修饰电极.

将5.0 μL浓度为1.00×10-5mol·L-1的探针DNA滴涂到构建的修饰电极表面，4 ℃条件下放置2 h.然后将其浸泡到质量分数为0.1% SDS 溶液中5 min，接着用重蒸水冲洗电极3次，完成探针DNA/金纳米-石墨烯修饰电极（sDNA/Au NPs-rGO/GCE）的制备.

1.5 电化学检测

首先，将不同浓度的目标DNA 先与200 μL 负载到Au NPs 上的信使DNA 在37 ℃杂交液中杂交45 min［13］，然后将探针DNA/金纳米-石墨烯修饰电极浸泡到含有目标DNA 与信使DNA 的杂交液中，在37 ℃条件下杂交2 h.之后用质量分数为0.1% SDS 溶液和蒸馏水冲洗电极3 次，除去没有杂交的目标DNA与信使DNA.

采用差示脉冲伏安法（DPV）作为检测手段，检测液为0.10 mol·L-1PBS缓冲液（pH 7.4）.通过检测杂交后硫堇产生的电流信号，发现与目标DNA杂交后硫堇的还原峰电流与目标DNA浓度的对数呈现良好的线性关系，进而可实现对目标DNA的定量分析.

2 结果与讨论

2.1 传感器的制备原理

传感器的构建过程如图1所示，还原石墨烯的存在增大电极的比表面积，加快电子的传递能力.纳米金具有优良的光电效应，而且生物相容性好，可以通过金-硫键来固定一端修饰有巯基的探针DNA.同时制备一种信使DNA-硫堇-金纳米粒子复合物，当加入目标DNA时，探针DNA与信使DNA可以和目标DNA分段互补进行杂交反应，形成一种“夹心型”的结构.杂交后，连接在复合物上的硫堇也被修饰到电极表面，硫堇是一种电活性物质，可以产生很强的电信号，并且目标DNA的浓度越大，杂交的信使DNA的数量越多，接上的硫堇的量也越多，通过产生的电信号响应值从而实现对目标DNA的定量检测.

图1 DNA生物传感器的构建原理图

2.2 金纳米粒子-石墨烯/玻碳电极修饰电极的表征

本实验中，扫描电镜（SEM）用来表征修饰电极材料，结果如图2所示.图2A清楚地显示还原石墨烯光滑的褶皱片层结构.当在其表面电沉积金纳米粒子以后，可以看到金纳米粒子大量地分布在电极表面（如图2B所示）.

图2 不同修饰电极的扫描电镜图

2.3 实验条件优化

实验中对信使DNA-硫堇-金纳米粒子复合物中加入硫堇量以及杂交时间进行优化，结果如图3 所示.当加入的硫堇（0.01 mmol·L-1）体积从50 μL 增加到200 μL 时，硫堇的电信号响应值是逐渐增大的（保持目标DNA的浓度为一常量），当硫堇体积超过200 μL时电流基本不再变化（如图3A所示），表明硫堇与金纳米粒子的结合量达到饱和.还对DNA 的杂交时间进行考察，从图3B 中可以看出杂交时间从0.5 h变化到2.0 h时，随着杂交时间的增加，硫堇的信号值逐渐增大，2 h后峰电流值基本不再变化，所以选择的最佳杂交时间为2 h.按照文献［14-15］，选择的金纳米粒子最佳电沉积时间为20 s.检测液pH 值为7.4，其原因是硫堇的信号强度与pH有关，它的电极反应是一个2电子及2质子的过程.同时，由于DNA在过高及过低的酸度条件下容易变性，因此选择在生理pH条件下进行测试，其pH值选择7.4.

图3 实验条件优化

2.4 分析性能

通过差示脉冲伏安法（DPV）检测传感器的分析性能.如图4A所示，在最佳实验条件下，传感器与不同浓度的目标DNA进行杂交，结果表明检测信号随着DNA浓度的增大而增强，并且在目标DNA浓度为1.00×10-16mol·L-1~1.00×10-9mol·L-1范围内，硫堇的电化学信号与DNA浓度的对数与呈现良好的线性关系（图4B所示），线性回归方程为I（μA）=202.9+11.97 log C（DNA浓度单位是mol·L-1），线性相关系数达到0.998 9，检测限达到3.5×10-17mol·L-1（信噪比为3）.说明该生物传感器具有良好的灵敏性.

图4 传感器的分析性能

2.5 选择性

本实验中，还对传感器的选择性进行考察.实验中选择3种单碱基错配DNA、完全错配DNA以及完全互补DNA 序列分别与探针以及信使DNA 进行杂交.杂交后归一化的结果如图5 所示，与单碱基错配DNA 杂交后电流值约是完全互补DNA 序列信号的40%，而完全错配DNA 杂交后信号响应值最小，只有完全互补DNA 信号的6%.表明该生物传感器选择性好，可以很好地区分单碱基错配DNA 与完全互补DNA.

图5 传感器与不同DNA序列杂交后的电流值的归一化图

3 结论

本文构建一种基于金纳米粒子-石墨烯的修饰电极，该修饰电极具有高的比表面以及很好地导电性.同时，制备一种信使DNA-硫堇-金纳米粒子-复合物，通过检测硫堇的电信号值实现对目标DNA的定量分析.该生物传感器制备过程简单，灵敏度较高，选择性好，为其他高灵敏生物传感器的制备提供思路.