荷叶总生物碱的制备方法研究

★ 陈强 杨维丹 刘永静（福建中医药大学药学院 福州 350122）

荷叶是睡莲科植物莲Nelumbo nuciferaGaertn.的干燥叶，味苦，性平，归肝、脾、胃经，主要用于治疗暑热烦渴，暑湿泄泻，脾虚腹泻，便血崩漏，血热吐衄等证［1］。荷叶作为一味药食同源的中药，既可在治疗疾病中发挥药效，又可在平时泡茶饮或烹饪中起保健作用，这些功效是基于荷叶中主要含有生物碱类、黄酮类、挥发油类等成分［2］。其中对荷叶中生物碱的研究始于19世纪，自日本学者福田真雄等［3］从荷叶中分离出荷叶碱、莲碱及O-去甲基荷叶碱3个单体成分以来,随着现代科技的进步，人们已从荷叶中发现27种荷叶生物碱单体化合物［4］。现代药理学研究表明，荷叶中含有的生物碱在降血脂、抑菌、抗炎、降糖等方面具有明显的药理活性［5-8］，具有一定的应用前景。但是荷叶中含有的生物碱类成分含量较低，提取纯化方法操作繁琐［9-10］，因此，研究高纯度、操作简便的荷叶中生物碱的提取纯化方法成为关键问题，本研究建立大孔吸附树脂-分散固相萃取法结合的荷叶生物碱的纯化方法，经过两步纯化以提高荷叶总生物碱的含量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

U-3000高效液相色谱仪，UV检测器（美国DIONEX公司）；XS 105型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；RE-2000A旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。

1.2 试药

荷叶碱对照品（纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司，批号：W03J8Z27223）。荷叶药材（产地湖南），购自江西樟树天齐堂中药饮片有限公司。

甲醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；甲醇（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙腈（色谱纯，西陇化工有限公司）；三乙胺（分析纯，西陇化工有限公司）；冰醋酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；D-101大孔吸附树脂（河北沧州宝恩吸附材料有限公司）；氨水（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；高分子阳离子交换填料（PCX，40～60 μm，天津博纳艾杰尔公司）；水为超纯水，由Milli-Q纯水系统制备。

2 方法与结果

2.1 荷叶碱的含量测定方法

2.1.1 色谱条件Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，流动相为乙腈-水（每1 000 mL水中含有25.5 mL三乙胺，11 mL冰醋酸，49∶51）；柱温为30 ℃，检测波长270 nm，进样量10 μL。

2.1.2 对照品溶液的配制精密称取荷叶碱对照品4.92 mg，置10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即为对照品储备液；精密吸取上述对照品储备液1 mL至25 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成荷叶碱对照品溶液。

2.1.3 线性关系的考察取荷叶碱对照品溶液，分别精密进样1、2、5、10、20 μL，以对照品的质量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，建立荷叶碱的标准曲线。实验结果表明，荷叶碱在0.019 7～0.393 6 μg范围内呈现良好的线性关系，线性回归方程为Y=31.352X-0.001 9（r=0.999 9）。

2.2 荷叶生物碱提取工艺优选

采用乙醇加热回流的提取方法对荷叶中生物碱类成分进行提取，并对乙醇浓度、料液比、提取时间、提取次数进行考察，优化荷叶总生物碱的提取条件。

2.2.1 乙醇浓度的考察分别以75%、80%、85%、90%的工业乙醇作为提取剂，在料液比（g/mL）为1∶50的条件下进行回流提取，提取2次，每次1.5 h，以考察乙醇浓度对荷叶碱提取率的影响，结果见图1（A）。由图可知当乙醇浓度为85%时，荷叶碱的提取率最高，因此，选择85%的乙醇作为提取溶剂。

2.2.2 料液比的考察在以85%乙醇为提取溶剂、提取2次、每次1.5 h的提取条件下，分别考察了料液比（g/mL）为 1∶10、1∶25、1∶50、1∶100对荷叶碱提取率的影响。结果见图1（B）。由图可知，当料液比为1∶50时荷叶碱的提取率最高，因此，确定料液比为1∶50。

2.2.3 提取时间的考察在以85%乙醇作为提取剂、料液比（g/mL）为1∶50、提取次数为2次的条件下，分别考察了提取时间为1.0、1.5、2.0、2.5 h对荷叶碱提取率的影响，结果见图1（C）。由图可知表明提取时间对荷叶碱的提取率影响不大，最终确定最优提取时间为1.5 h。

图1 乙醇浓度（A）、料液比（B）、提取时间（C）和提取次数（D）对荷叶碱提取率的影响

2.2.4 提取次数的考察以85%乙醇作为提取剂，在料液比（g/mL）为1∶50的条件下进行回流提取，分别考察了提取次数为1、2、3、4次对荷叶碱提取率的影响，每次1.5 h，结果见图（1D）。由图可知，当提取3次时，荷叶碱的提取率最高，但提取2次与提取3次的荷叶碱的提取率相差不大，因此，综合考察到实验效率，最终确定提取次数为2次。

2.2.5 最佳工艺确认综上所述，可知荷叶生物碱乙醇回流提取的最佳条件为：85%乙醇为提取溶剂，料液比为1∶50，每次提取1.5 h，共提取2次。在上述最佳实验条件下进行3次提取实验，得到荷叶碱的提取率分别是0.089 5%、0.087 4%、0.088 9%，平均提取率为0.088 6%，RSD为1.2%。

2.3 大孔吸附树脂纯化工艺的优化

2.3.1 实验方法精密称取预处理好的D101大孔吸附树脂250 g，进行湿法装柱，用工业乙醇洗至流出液与水混合（V∶V=1∶5）不产生白色浑浊，再用蒸馏水洗至流出液无醇味即可，放置一夜。将“2.2”项优化后得到的醇提液进行浓缩，浓缩至每毫升醇提物相当于原药材0.15 g进行上样，上样体积为1 BV，待吸附2 h后开始洗脱。然后进行洗脱，首先用4 BV蒸馏水进行洗脱，再分别用4 BV 30%、50%、60%、70%工业乙醇依次洗脱，合并收集1～3 BV 60%乙醇、1～3 BV 70%乙醇洗脱液，回收溶剂，蒸干，得固体粉末，即为荷叶大孔树脂纯化物。

2.3.2 泄露曲线的考察精密称取预处理过的D101大孔吸附树脂250 g湿法装柱，分别以0.5 BV、1 BV、1.5 BV、2 BV上样，接收柱后流出液，测定其中荷叶碱的浓度。结果见图2。由图可知当上样体积达到1.5 BV时，流出液中荷叶碱浓度突然变大，说明此时大孔吸附树脂已经达到了饱和，因此，确定最佳上样体积为1 BV。

图2 大孔吸附树脂的泄漏曲线

2.3.3 洗脱液浓度的考察精密称取预处理过的大孔吸附树脂250 g湿法装柱，1BV上样，上样2 h后开始洗脱，先以4 BV的水洗脱，再分别以30%、50%、60%、70%（4 BV）的乙醇洗，每0.5 BV单独接收洗脱液，测定洗脱液中荷叶碱的浓度。结果表明，1～3 BV 50%、60%、70%的乙醇洗脱液中荷叶碱的含量均较高，因此分别单独接收50%、60%、70%洗脱液1～3 BV，回收溶剂，干燥，测定不同乙醇浓度纯化物中荷叶碱的含量。结果表明，60%和70%乙醇所得到的纯化物中荷叶碱的含量高于50%乙醇所得的纯化物。因此，确定接收1～3 BV 60%乙醇、1～3 BV 70%乙醇洗脱液。

2.3.4 大孔吸附树脂纯化工艺的确认按“2.3.1”最优大孔吸附树脂纯化工艺进行3次确认实验，回收乙醇，干燥得大孔吸附树脂纯化物。取大孔吸附树脂纯化物约0.2 g，精密称定，用甲醇适量溶解并稀释至25 mL，再精密吸取0.5 mL至10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，用液相色谱法分析，计算荷叶碱的含量，分别为7.40%、7.27%、6.84%。结果表明，三批次的大孔树脂纯化物中荷叶碱的含量为6.84%～7.40%。

2.4 PCX分散固相萃取工艺的优化

2.4.1 实验方法取大孔吸附树脂纯化物约0.2 g,加甲醇溶解并稀释至100 mL，分别加入到盛有PCX填料（每10 mL溶液对应于300 mg PCX）的烧杯中，磁力搅拌5 min后，进行抽滤，将PCX转移至另一烧杯中，再加入4倍体积的甲醇，磁力搅拌5 min后，进行抽滤；再将PCX转移至烧杯中，加入3倍体积的5%氨-甲醇溶液，磁力搅拌5 min后，进行抽滤，收集5%氨-甲醇洗脱液,回收溶剂，干燥得固体粉末，即为荷叶生物碱纯化物。

2.4.2 PCX用量的考察取大孔吸附树脂纯化物0.2 g,加甲醇溶解并稀释至100 mL，量取上述溶液10 mL,分别置于装有 50、100、150、200、250、300、350、400 mg PCX填料的烧杯中，按“2.4.1”进行纯化，分别测定每个母液中荷叶碱的浓度。结果见图3（A）。由图可知，当PCX用量达到300 mg时，母液中的荷叶碱含量比较小，说明绝大部分的生物碱已被PCX所吸附，当继续增加填料用量时，母液中的荷叶碱浓度并未见明显降低，说明填料用量达到饱和状态，因此，PCX填料的用量选择为每10 mL大孔吸附树脂纯化物为300 mg的PCX。

2.4.3 5%氨-甲醇用量的考察取大孔吸附树脂纯化物0.2 g,加甲醇溶解并稀释至100 mL，量取上述溶液10 mL,置于盛有300 mg PCX 填料的烧杯中，按“2.4.1”进行纯化，通过进行多次用小体积（10 mL）洗脱剂洗脱，将洗脱液进HPLC分析，测定洗脱液中荷叶碱的浓度，结果见图3（B）。由图可知，荷叶碱的浓度在使用第1个10 mL洗脱剂时最大，说明大部分的荷叶生物碱类成分在第1个10 mL洗脱剂时被洗脱下来，且随着洗脱剂体积的不断增加，不断有生物碱类成分被洗脱下来。但第4个10 mL（总量40 mL）洗脱剂中生物碱的峰面积非常小，说明通过前3个10 mL洗脱剂的洗脱，大部分生物碱都洗脱下来了。因此，综合考虑到荷叶碱的洗脱率与实际操作，最终选择30 mL 5%氨-甲醇进行洗脱。

2.4.4 氨浓度的考察取大孔吸附树脂纯化物0.2 g,加甲醇溶解并稀释至100 mL，量取上述溶液10 mL,置于盛有300 mg PCX 填料的烧杯中，按“2.4.1实验方法”进行纯化，分别加入30 mL 0.2%、2%、5%、10%氨-甲醇进行洗脱，收集洗脱液进行分析，结果见图3（C）。由图可知，当氨水浓度在0%～5%变化时，随着氨水浓度的增加，洗脱液中荷叶碱的浓度增加，说明在碱性条件下，荷叶碱从强阳离子交换树脂中缓慢地被洗脱出来，在氨水浓度为5%时，峰面积达到最大。但当氨浓度继续增加至10%时，洗脱液中荷叶碱的峰面积并未见明显增加，因此选择5%为最佳氨浓度。

图3 PCX的用量（A）、洗脱剂的体积（B）和氨浓度（C）对荷叶碱纯化的影响

2.4.5 最佳条件的验证在上述最佳实验条件下，按“2.4.1”进行纯化，平行3次，得荷叶总生物碱纯化物。取荷叶总生物碱纯化物约6 mg，精密称定，至100 mL量瓶中，加甲醇适量溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，即得供试品溶液。荷叶碱的含量及转移率结果见表1。

表1 荷叶总生物碱纯化物中荷叶碱的含量及转移率 %

3 讨论

目前，对荷叶中生物碱类成分进行纯化的方法主要有溶剂萃取法、大孔吸附树脂柱色谱法、离子交换柱色谱法等，而溶剂萃取法会使用大量的盐酸、三氯甲烷等刺激性、毒性较大的溶剂，造成实验操作不便和环境污染等问题，而采用大孔吸附树脂或离子交换树脂柱色谱法进行一次纯化时，存在纯化后荷叶生物碱纯度不高的问题。本研究在采用大孔吸附树脂初步纯化后，采用分散固相萃取法进行进一步纯化，分散固相萃取法与传统的柱色谱法相比，具有操作简单、节省时间等优点，大大提高了纯化的效率。

经本方法制备所得的荷叶总生物碱纯化物中生物碱类成分的含量较高，荷叶药材中荷叶碱的含量约为0.085%，而总生物碱纯化物中荷叶碱的含量可达30%，提高了约350倍。此外对总生物碱纯化物中O-去甲基荷叶碱、N-去甲基荷叶碱、莲碱的含量也进行了含量测定，三者的含量分别达到9.93%～11.36%、1.96%～2.99%、2.17%～2.67%。

本方法采用大孔吸附树脂-分散固相萃取两种方法结合，建立了荷叶中总生物碱成分的制备方法及对促进荷叶资源的合理利用，加强荷叶减肥降脂其相关产品的深度开发具有重要的意义。