HPLC法测定不同产地山香圆叶中齐墩果酸和熊果酸的含量

★ 李瑶芳 刘明颖 邓双炳 王章伟 王振 黄冰峰 刘地发（1.创新天然药物与中药注射剂国家重点实验室 江西 赣州 341000；2. 江西青峰药业有限公司 江西 赣州 341000）

山香圆叶为省沽油科植物山香圆Turpinia argutaSeem.的干燥叶，广泛分布于江西、福建、湖南、广东、海南、广西、四川、贵州等地，夏、秋二季采收，味苦，性寒，归肺、肝经，具有清热解毒、利咽消肿、活血止痛的功效，用于乳蛾喉痹、咽喉肿痛、疮疡肿毒、跌扑伤痛［1］，现代药理研究表明其具有抗炎［2］、抗菌、镇痛［3］、免疫调节［4］、抗氧化等活性。山香圆叶中主要含有黄酮类、五环三萜类、有机酸类及甾醇类化合物，孙敬勇［5］通过分离提取得到山香圆叶中五环三萜化合物具有抗炎和清除自由基的活性。《中国药典》2020年版中山香圆叶含量测定项为黄酮类成分女贞苷和野漆树苷，另有文献报道关于五环三萜类成分的测定方法是采用薄层色谱法和液相色谱法测定其熊果酸的含量［6］，未见同时测定齐墩果酸和熊果酸含量的报道，而齐墩果酸具有较强的抗菌作用［7］，为山香圆叶重要的抗炎活性成分之一。本文通过建立山香圆叶中齐墩果酸和熊果酸含量测定的方法，为山香圆叶及其制剂的质量控制提供依据。

1 仪器与试剂

Agilent1260高效液相色谱仪（安捷伦公司）；百万分之一天平（梅特勒-托利多科技有限公司，XPE26）；万分之一天平（梅特勒-托利多科技有限公司，ML204T）；KQ-300DE超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

熊果酸对照品（批号：110742-201823，含量：99.30%），齐墩果酸对照品（批号：110709-201808，含量：91.10%）均购于中国食品药品检定研究院，供含量测定用；甲醇、乙腈均为色谱纯，乙醇、磷酸为分析纯，水为超纯水。不同产地山香圆叶样品共30批，采自各产地，经鉴定为Turpinia argutaSeem.的干燥叶。

表1 30批山香圆叶样品信息

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

分别取齐墩果酸对照品1.2 mg和熊果酸对照品2.5 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2 供试品溶液的制备

取山香圆叶粉末（过三号筛）约1.0 g，精密称定，置25 mL量瓶中，加入乙醇至近刻度，超声处理（功率300 W，频率40 kHz）40 min，取出，放冷，再加乙醇至刻度，摇匀，经0.45 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件

色谱柱为ACE Excel 3 C18-AR（4.6 mm×150 mm，3 μm）；流动相A为甲醇-乙腈（3∶1），B为0.2%磷酸溶液，梯度洗脱程序（0～33 min，80%A；33～38 min，80%～95%A ；38～40 min，95%～80%A ；40～50 min，80%A）；检测波长为210 nm；柱温为20 ℃；流速为1.0 mL/min；进样体积为20 μL。

2.4 专属性

在“2.3”色谱条件下，分别精密吸取空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各20 μL注入液相色谱仪，结果见图1。结果表明，空白溶剂无干扰，对照品溶液和供试品溶液中的齐墩果酸和熊果酸分离度良好，方法的专属性良好。

图1 各样品HPLC色谱图

2.5 线性关系考察

精密称取齐墩果酸2.5 mg、熊果酸4.8 mg，同置于100 mL量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，得到齐墩果酸和熊果酸的对照品贮备液。精密移取5，7.5，10，12.5，15 mL分别置于20 mL量瓶中，加乙醇稀释至刻度。分别精密吸取20 μL注入液相色谱仪，在“2.3”条件下进行测定，以进样浓度（μg/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。齐墩果酸、熊果酸的回归方程分别为：Y=10.300X-0.598（r=0.999 9）和Y=9.283X-2.251（r=0.999 9），表明齐墩果酸、熊果酸分别在5.780 3～17.340 9 μg/mL和12.170 3～36.511 0 μg/mL浓度范围内线性关系良好。

2.6 精密度试验

按“2.2”项下方法制备6份供试品溶液进行重复性考察，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各20 μL注入液相色谱仪，按“2.3”进行测定，测得齐墩果酸、熊果酸含量并计算其RSD，分别为1.3%和2.3%，表明方法的重复性良好。

2.7 准确度试验

取同一样品约0.5 g，精密称定，称取9份，分别置25 mL量瓶中，分成3组，每组分别加入50%、100%、150%量的齐墩果酸和熊果酸对照品溶液，按“2.2”项制备方法制备，测定齐墩果酸和熊果酸的含量。见表2。

表2 加样回收结果

2.8 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24，48 h精密吸取20 μL注入液相色谱仪，在“2.3”条件下进行测定，测得齐墩果酸、熊果酸峰面积的RSD分别为3.0%和1.2%，结果表明供试品溶液在48 h内稳定。

2.9 样品含量测定

取不同产地的山香圆叶（过三号筛）样品1.0 g，按“2.2”项下方法制成供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下，测量峰面积并用外标法计算样品中齐墩果酸与熊果酸的含量，样品含量测定结果见表3。

表3 30批山香圆叶齐墩果酸和熊果酸的含量测定结果 %

2.10 聚类分析

将30批山香圆叶样品的齐墩果酸和熊果酸的含量，应用SPSS 21.0软件，采用组间连接法，以欧式平方距离为测度，Z值标准化后，对样品进行聚类分析，结果见图2。从聚类结果可以看出，30批山香圆叶中熊果酸和齐墩果酸的含量差异较大，且与产地相关性较小，熊果酸的含量均相对高于齐墩果酸的含量，另熊果酸含量较高的批次，齐墩果酸的含量也较高，但二者的含量不成比例，其中重庆秀山梅江镇20181210-9、江西安远20181204-5、江西于都20181204-6、贵州松桃太平镇20181210-7，4批的齐墩果酸和熊果酸含量较高。30批山香圆叶中齐墩果酸的平均含量为0.035%，熊果酸的平均含量为0.058%。

图2 30批山香圆叶齐墩果酸和熊果酸含量聚类分析树状图

3 讨论

3.1 提取方式考察

齐墩果酸和熊果酸为五环三萜类化合物，为同分异构体，常常同时存在于药材中。本实验对样品提取过程进行单因素考察，确定最佳提取条件：提取溶剂为乙醇、料液比1∶25、提取时间40 min、提取方式超声提取。

3.2 流动相体系的考察

本实验分别考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸溶液、甲醇-冰醋酸溶液、甲醇-甲酸溶液、甲醇-乙腈-磷酸溶液、甲醇-乙腈-甲酸溶液等流动相，结果表明甲醇-0.2%磷酸（87∶13，V/V）溶液时，齐墩果酸、熊果酸和熊果酸右侧色谱峰都能完全分离，但是随着色谱柱柱效下降，熊果酸和熊果酸右侧色谱峰分离度逐渐降低，无法完全分离，影响目标成分积分，而在系统中添加一定量的乙腈可以大大增加熊果酸和熊果酸右侧峰的分离度，因此最终选择的流动相体系为甲醇-乙腈（3∶1）-0.2%磷酸。

因为齐墩果酸和熊果酸为三萜类化合物，仅有末端吸收，色谱柱中化合物的残留影响基线，因此采用梯度洗脱，有机相上升至95%导致出现一个较大的梯度峰，可以使色谱柱洗脱较为完全，同时对目标化合物的含量测定没有影响。

3.3 色谱柱的选择

色谱柱选择ACE Excel 3 C18-AR（4.6 mm×150 mm，3 μm）色谱柱采用了特殊开发的配体，将C18链与完整苯基官能团结合在一起，从而将C18和苯基特征的优点结合到单个相中，可以使齐墩果酸和熊果酸达到完全分离。柱温为20 ℃、流速为1.0 mL/min，齐墩果酸和熊果酸可以完全分离，且基线较为平稳。

3.4 耐用性考察

采用同一参数，流速（1.0±0.1）mL/min、柱温（20±5）℃、波长（210±2）nm、流动相（甲醇-乙腈 ＜3∶1＞）-0.2% 磷酸为（80±2）∶（20±2），磷酸（0.2±0.02）%、色谱柱（ACE Excel 3 C18-AR，4.6 mm×150 mm，3 μm）条件下测得含量的RSD（n=6）均在6.0%以内，说明本方法的耐用性良好。其中色谱柱ACE Excel 3 C18-PFP（4.6 mm×150 mm，3 μm）无法将齐墩果酸和熊果酸分离，不适用于山香圆叶中熊果酸的含量测定。

3.5 方法准确度

在上述色谱条件下测得山香圆叶中齐墩果酸和熊果酸的平均含量分别为0.035%和0.058%，齐墩果酸的回收率在96.82%～103.06%，RSD为2.3%，熊果酸的回收率在92.87%～100.61%，RSD为2.4%，符合《中国药典》2020年版四部通则9101中待测成分含量0.1%，回收率限度90%～108%的要求。

综上所述，本研究通过HPLC法，成功检测了山香圆叶中齐墩果酸和熊果酸的含量。该方法简单、灵敏度高、分离度好、回收率高，为山香圆叶及其制剂的质量控制提供了检测方法和参考依据。