UPLC-HRMS结合质谱分子网络高通量分析人血浆中的代谢物

熊 倩，杨丽娟，丁筱雪，李文婷，易伦朝，张 宏,3

(1.昆明理工大学食品科学与工程学院，云南 昆明 650500；2.昆明理工大学附属医院，云南省第一人民医院心血管内科，云南 昆明 650032；3.昆明理工大学生命科学与技术学院，云南 昆明 650500)

代谢组学旨从生物系统中尽可能多地收集代谢信息，可直接反映生物事件，具有重复性好、效率高等优点[1-2]，已成为生命科学研究领域强有力的工具。代谢组学具有靶向和非靶向性。靶向代谢组学针对已知代谢物，定量精度高，易于实现；非靶向代谢组学旨从样本中检测尽可能多的代谢物，覆盖面更广[1,3-4]。目前，核磁共振、质谱等分析技术均成功应用于代谢组学研究，其中，液相色谱-质谱联用技术应用最广泛[5]。

超高效液相色谱-高分辨质谱(UPLC-HRMS)具有高分辨率、高灵敏度等特点，适用于检测未知化合物[6]，能够精确测量化合物的相对分子质量，从而预测元素组成。通过二级质谱(MS/MS)或多级质谱(MSn)得到丰富的碎片离子，可在缺少化学标准品的情况下推测代谢物的化学结构[7]。但由于高分辨质谱获得数据的高复杂性，目标代谢物易受到其他代谢物或基质的干扰，甚至在某些情况下，干扰离子的强度远高于目标离子，从而难以从原始数据中快速鉴定目标代谢物，增加了代谢物定性分析的难度[8]。因此，快速、高效、准确地定性代谢物仍是代谢组学研究中一项极具挑战性的工作。

质谱分子网络(MSMN)利用 MS/MS碎片的相似性组织串联质谱数据，通过计算由质荷比(m/z)和产物离子强度生成的向量余弦值确定MS/MS结构相似性[9]。具有相似结构基团的代谢物会产生相似的MS/MS数据，MSMN将这些代谢物聚集在一起，将种子化合物输入完全未知的分子网络时，种子化合物生成的节点可以合并成类似的簇，以记录这些类似物的结构特征[10-11]。MSMN采用结构化的方式组织和分析非靶向串联质谱实验数据，将数据信息可视化，使代谢物的结构更易识别，加快了鉴定未知代谢物的进程，增强了定性未知代谢物的覆盖面和可信度，有利于代谢组学研究[9,12-13]。该技术应用潜力巨大[14]，已用于植物提取物[15]、微生物[16]、尿液[17]、血浆[18]中代谢物的定性分析。

Folch方法出现于1957年[19]，利用氯仿-甲醇-水溶液(8∶4∶3，V/V/V)的混合溶剂提取脂类代谢物，被誉为脂质提取方法的“金标准”[20]。本研究拟利用Folch方法提取血浆，得到水相和有机相中的代谢物信息，运用UPLC-HRMS技术检测代谢物，以标准品准确定性的代谢物为种子化合物，采用MSMN筛选挖掘与种子化合物质谱特征相似的代谢物，并将该方法用于人血浆中多类代谢物的定性分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UltiMate 3000超高效液相色谱仪、Q-Exactive Focus轨道离子阱高分辨质谱仪：美国赛默飞世尔科技公司产品；超声波清洗机：天津市恒奥科技发展有限公司产品；电子分析天平：上海梅特勒-托利多仪器有限公司产品；超纯水机：德国Merck公司产品；鼓风干燥箱：天津泰斯特仪器有限公司产品。

甲醇、乙腈、甲酸、异丙醇：质谱级，德国Merck公司产品；氯仿、甲酸铵：分析级，上海阿拉丁公司产品；内标溶液12-[[(环己基氨基)羰基]氨基]-十二烷酸(CUDA)：美国Cayman公司产品；29种标准品信息列于附表1(请登录《质谱学报》网站www.jcmss.com.cn下载，以下同)。

1.2 实验方法

1.2.1血浆样本的采集 人血浆样本采自云南省第一人民医院，志愿者在空腹8 h后，于清晨从肘静脉采血，经肝素锂抗凝，4 ℃静置3 h后，以3 000 r/min离心20 min，取上清液，于-80 ℃冻存。本研究已通过云南省第一人民医院伦理审查委员会的批准，并获得了所有参与者的知情同意。

1.2.2血浆样本的前处理 取出-80 ℃冰箱中的血浆样本，在4 ℃缓慢溶解，涡旋1 min。准确吸取20 μL血浆，加入10 μL内标溶液(CUDA，2.0 mg/L)、320 μL冰甲醇，涡旋10 s；加入640 μL冰氯仿，涡旋10 s；再加入240 μL过膜水，涡旋20 s；静置10 min后，以14 000 r/min离心5 min；收集有机相(下层)，用氯仿-甲醇-水溶液(8∶4∶3，V/V/V)提取水相；合并2次收集的有机相和水相，氮气吹干后分别复溶(有机相采用300 μL氯仿-甲醇溶液(2∶1，V/V)；水相采用200 μL甲醇)；然后分别将两相溶液过膜后转入进样瓶中，待分析。

1.3 实验条件

1.3.1色谱条件 有机相分析条件：ACE3 C18色谱柱(150 mm×3.0 mm×3.0 μm)；流动相：A为异丙醇-乙腈(90∶10，V/V)和5 mmol/L甲酸铵，B为乙腈-水(60∶40，V/V)和5 mmol/L甲酸铵；自动进样盘温度4 ℃；柱温50 ℃；流速0.2 mL/min；进样量1 μL；梯度洗脱程序：0～3 min(30%A)，3～5 min(30%～50%A)，5～12 min(50%～82%A)，12～28 min(82%～99%A)，28～28.01 min(99%～30%A)，28.01～30 min(30%A)。

水相分析条件：ACE3 C18色谱柱(150 mm×3.0 mm×3.0 μm)，流动相：A为乙腈，B为0.1%甲酸水溶液；自动进样盘温度4 ℃；柱温35 ℃；流速0.2 mL/min；进样量2 μL；梯度洗脱程序：2～9 min(5%～38%A)，9～14 min(38%～68%A)，14～22 min(68%～100%A)，22～32 min(100%～5%A)。

1.3.2质谱条件 采用电喷雾离子源(ESI)；喷雾电压4.0 kV(+)、3.5 kV(-)；全扫描质量范围m/z100～1 200；分段扫描质量范围m/z100～300、299～600、599～760、759～860、859～1 200；鞘气流速45 L/min(+)、40 L/min(-)；辅助气流速15 L/min(+)、20 L/min(-)；传输毛细管温度350 ℃(+)、320 ℃(-)；全扫描(full scan)分辨率70 000；数据依赖二级扫描(dd MS2)分辨率35 000；隔离窗口设置：m/z1；最大注射时间100 ms(MS)、50 ms(MS/MS)；自动增益控制(AGC)：106(MS)、105(MS/MS)；高能碰撞诱导电压15、35、65 eV。

1.4 数据处理流程

代谢物的定性分析方法：参考文献[21-25]对代谢物进行分级定性。第1级：与标准品的保留时间、一级质谱(MS)、二级质谱(MS/MS)对比定性；第2级：结合参考文献，与HMDB、Massbank、Lipidmaps数据库提供的MS、MS/MS对比定性；第3级：仅基于一级质谱特征定性；第4级：未能鉴别的同分异构体。

MSMN筛选代谢物及定性分析流程：1) 采用MZ mine-2.38[26]软件对原始数据进行色谱峰的构建、平滑、解卷积、峰对齐等处理；2) 通过数据转换软件MS convert将MZ mine-2.38处理后的数据转换为.mzXML格式；3) 使用RStudio1.0.44运行自编R语言脚本文件，对提取的包含二级质谱信息的数据进行质谱相似度计算；4) 使用Cytoscape软件构建MSMN图；5) 匹配HMDB、Massbank、Lipidmaps数据库、查阅文献，利用诊断碎片离子分析MSMN图，实现对其中代谢物的分类鉴定。

2 结果与讨论

2.1 有机相的定性结果

采用Folch方法提取血浆中的代谢物，定性检测到有机相中107个脂类代谢物，其中第1级14个，第2级91个，第4级2个，有64个代谢物辅以MSMN定性得到，其结果列于附表2。

2.1.1结合MSMN鉴定PC类代谢物 以PC(16∶0/18∶2)为例解释PC的裂解规律，示于图1。在正离子模式下，其头部基团磷酸胆碱断裂产生m/z184.073 3碎片离子，可作为该类代谢物的诊断离子碎片。另外，还会产生MS/MS碎片离子m/z104.107 0、124.999 8、86.096 4[27-28]，可辅助用于PC的鉴定分析。

注：PC(16∶0/18∶2)图1 正(a)、负(b)离子模式下，PC可能的裂解途径及血浆样本中PC的MS/MS图(c)Fig.1 Possible fragmentation pathways of PC in positive (a) and negative (b) ion modes,and MS/MS spectra of PC in plasma sample (c)

正离子模式下，PC、SM的质谱分子网络图示于图2。分析MSMN的关键在于寻找种子化合物，根据标准品定性出LPC(16∶0)(溶血磷脂酰胆碱(16∶0))，其在图2中对应ID 43，因此暂将该簇认定为PC类代谢物。以ID 43的相邻节点ID 165为例，阐述PC类代谢物的定性过程。由于R基侧链的不同，导致PC性质不同，已知ID 43为LPC(16∶0)，分子式为C24H50NO7P，准分子离子为m/z496.339 8，与ID 165的准分子离子m/z522.355 4相差26.015 6 u，推测为1个C2H2，则ID 165的分子式为C26H52NO7P，可推算其酰基链上R基的碳链为C17H34，计算不饱和度U=(2×17+2-34)/2=1，因此推测其为LPC(18∶1)。同时，其二级质谱含有m/z184.073 2、124.999 8、104.107 3、86.096 9等碎片离子，符合PC类代谢物的裂解规律，并与Massbank数据库收录信息一致，因此确定ID 165为LPC(18∶1)。其次，由于PC类代谢物的区域异构体Sn-1先于Sn-2洗脱出来，Sn-1的峰强度小于Sn-2[28]，从而识别了LPC(0∶0/18∶1)和LPC(18∶1/0∶0)，其谱图示于图3。根据以上特征，并结合实验室前期研究与参考文献[29]，共定性出43个PC类代谢物。

图2 正离子模式下，SM-PC的MS/MS(a)和MSMN(b)图，以及MSMN中被掩盖部分的放大图(c)Fig.2 MS/MS spectra (a) and MSMN (b) of SM-PC,and enlarged drawing of MSMN covered part (c) in positive ion mode

图3 正离子模式下，LPC(18∶1)的提取离子流图(a)和质谱图(b)Fig.3 Extracted ion chromatogram (a) and mass spectra (b) of LPC (18∶1) in positive ion mode

2.1.2结合MSMN鉴定SM类代谢物 SM的裂解规律示于图4，与PC具有相似的结构特征，其头部基团相同(均为磷酸胆碱)，其余部分脂质的裂解规律示于附图1。在正离子模式下，PC和SM均产生m/z184.073 3、124.999 8、104.107 0碎片离子，因此在MSMN图中聚成一簇。除此之外，SM还会产生m/z166.062 7特征碎片，但因其响应强度太低，在质谱中难以获得[28,30-31]，这给PC、SM的鉴定带来了一定困难。在负离子模式下，PC和SM表现出不同的裂解规律，PC主要产生m/z168.042 0、224.068 2碎片离子，SM也产生m/z168.042 0碎片离子，但其强度显著高于PC[30]，示于图5，据此可将PC与SM区分开。与PC类代谢物的定性流程类似，结合SM的裂解规律，将一级、二级质谱信息与HMDB、Lipidmaps等数据库匹配，共定性出14个SM类代谢物。

图4 正(a)，负(b)离子模式下，SM可能的裂解途径Fig.4 Possible fragmentation pathways of SM in positive (a) and negative (b) ion modes

注：括号内2.47、34.34分别代表特征碎片离子m/z 168.042 3的相对强度图5 负离子模式下，LPC(16∶0)与SM(d32∶1)的MS/MS质谱图Fig.5 MS/MS spectra of LPC (16∶0) and SM (d32∶1) in negative ion mode

此外，在负离子模式下鉴定PC、磷脂酰乙醇胺(PE)时，PE(36∶2)中出现了m/z224.069 3碎片离子，列于附表2，因此不能仅凭该碎片离子就认定某代谢物属于PC类；另外，还需注意排除代谢物的假阳性，如在图2中，ID231为LPC(16∶0)的Na加合物，但根据前体离子m/z518.321 3易将其错判为LPC(18∶3)。

2.2 水相的定性结果

水相中共定性出80个代谢物，根据标准品准确定性出13个代谢物；参考数据库或文献[32-33]定性出56个代谢物，其中10个代谢物辅以MSMN定性得到；仅基于一级质谱特征定性出11个代谢物，其结果列于附表3。分析结果表明，MSMN方法不适用于水相中代谢物的筛选。

代谢组学研究常采用甲醇沉淀蛋白法[34]提取血浆中的代谢物，该方法所获得的部分代谢物，如氨基酸及其衍生物、脂肪酸类、糖类等代谢物在Folch方法的水相中也可检测到。相比之下，Folch方法操作简单、覆盖面广泛，可检测到种类、数量更多的代谢物。

2.3 MSMN不适用于部分脂类代谢物及水相提取代谢物的原因

对于PE、磷脂酸(PA)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)等代谢物，大多可在负离子模式检测到，且特征碎片离子数量少、不同类间的差异性不显著、同类间的质谱相似性不强，难以在分子网络中聚集成簇。甘油三酯(TG)虽然在分子网络中聚集良好，但其结构特征受R支链变化的影响，共有碎片均为m/z81.070 4等小分子离子，代表性不强。因此难以实现分类定性，不适于用质谱分子网络辅助定性。

对于水相中的代谢物，虽然在MSMN中聚集度很好，但检测到的均为小分子代谢物，结构特征不显著，MS/MS碎片特征性不强，难以实现代谢物的分类鉴定。

3 结论

本研究采用UPLC-HRMS技术检测人血浆中的代谢物，结合MSMN方法分析鉴定高分辨质谱数据，共定性出187个代谢物。在有机相中，利用MSMN筛选定性出64个代谢物，其中只基于1个起点代谢物，定性出57个PC和SM。MSMN可缩短鉴定代谢物的时间，扩大未知代谢物定性的覆盖面，为代谢物的快速、准确定性提供了有效的方法。此外，在血浆代谢物的提取分析中，可共同分析由Folch方法提取到的水相和有机相，节约实验成本，实现了血浆中多类代谢物的同时分析鉴定。