直接注射-多级质谱全扫描法快速分析枸杞子化学成分组

贾金茹，彭 博，李 婷，刘文静，李 菡，李 波，赵云芳，宋月林

(1.北京中医药大学中药学院，中药现代研究中心，北京 100029；2.安利(中国)植物研发中心，江苏 无锡 214145)

枸杞子始载于《神农本草经》，被列为上品，其甘平而润、性滋补，《本草纲目》称其为“平补之药”。《中国药典(2020版)》规定，枸杞子为茄科植物宁夏枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果实，具有滋补肝肾、益精明目的功效，用于虚劳精亏、腰膝酸痛、眩晕耳鸣、阳痿遗精、内热消渴等病症[1]。现代药理研究表明，枸杞子具有抗肿瘤[2]、抗氧化[3]、抗衰老[4]、保护神经[5]、降血糖[6]等多种药理活性。枸杞子不仅是我国常用的滋补类中药，而且在许多国家和地区也作为功能性食品使用。由于巨大的市场需求，在我国的宁夏、甘肃、青海等地大规模栽培宁夏枸杞，年产量20万吨以上[7]，这给枸杞子样品的检测分析带来了极大挑战。

液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术已成为分析中药等复杂体系化学成分组成的主要工具[8]。近年来，色谱技术快速发展，特别是超高效液相色谱(UPLC)[9-10]和亚微米级色谱填料[11-12]的出现，使液相分析通量显著提高，单次分析所需时间可降到30 min以内，甚至10 min以内，但依然难以满足大规模样品分析的要求，且不稳定化学成分在与色谱填料接触的过程中可能发生降解。

数据依赖性采集(DDA)和数据非依赖性采集(DIA)是用于获取多级质谱信息(一般为MS2谱图)最常用的2种模式[13]。DDA能够明确地归属MS2质谱信号，但在色谱共流出情况下，难以全面采集所有化学成分的MS2图谱。DIA与DDA相反，其优点在于能够全面采集MS2图谱，但难以归属碎片离子。在理想的色谱分离情况下，DDA和DIA均能实现MS2图谱的全面采集和母离子的归属；而在无色谱分离情况下，气态分段技术(GPF)[14-15]的出现为通过直接注射(DI)建立复杂样品MS1-MS2数据列表提供了可能。作为最常用的GPF技术，SWATH[16]和多级质谱全扫描(MS/MSALL)[17]方法能将整个母离子流分割成宽度为25 u或者1 u的连续质谱窗。对于每个质谱窗，均采用DIA模式全面采集碎片离子信息，大大降低了碎片离子归属的难度。特别是MS/MSALL技术，首先快速采集样品的MS1谱图，然后将整个离子队列分成一系列连续单位质量(1 u)窗口，依次进入碰撞池，实现每个表观质量数的MS2谱图采集。理论上，只要不是同分异构体，或者具有相同表观质量数的化合物，均可以实现良好的分离。采用无色谱分离的DI进样模式，可以根据采集MS2图谱所需的时间设定进样时间，为所有二级图谱的采集提供了时间保障。

基于此，为快速、全面阐明枸杞子的化学成分组，本研究拟利用DI-MS/MSALL技术对枸杞子的提取物进行分析。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

TripleTOF 5600+质谱仪：美国Sciex公司产品，配有电喷雾离子源(ESI)及PeakviewTM1.2数据处理系统；冷冻干燥机：德国Christ公司产品；XS105型电子分析天平：瑞士Mettler Toledo公司产品；超声波清洗器：南京垒君达公司产品；离心机：德国Eppendorf公司产品；旋转蒸发仪：上海亚荣公司产品；Milli-Q超纯水系统：美国 Millipore 公司产品。

1.2 主要材料与试剂

枸杞子：采自宁夏中卫，经北京大学屠鹏飞教授鉴定为药材茄科植物宁夏枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果实；甲醇：质谱纯，美国Thermo Fisher公司产品；乙酸乙酯：分析纯，北京化工公司产品；超纯水：由实验室Milli-Q超纯水系统制备。

1.3 样品制备

取适量枸杞子，置于液氮中冷冻1 min，捣碎，真空冷冻干燥机干燥后粉碎，过2号筛。精密称取约1.0 g粉末，置于具塞三角瓶中，以50 mL 70%甲醇-水溶液超声提取40 min，静置放冷，用70%甲醇-水溶液补充失重。室温条件下以12 000 r/min离心10 min，取上清液，减压回收溶剂至近干，向其中加入25 mL水，待完全溶解后倒入分液漏斗中，加入等量的乙酸乙酯溶液，振摇3 min，静置分层，取乙酸乙酯层。重复上述操作3次，合并乙酸乙酯层溶液，减压回收溶剂至近干，加入40 mL甲醇溶液使其完全溶解，过0.22 μm滤膜，取续滤液，即得待测样品。

1.4 质谱条件

蠕动泵以10 μL/min将枸杞子提取液注入离子源，持续5 min，随后以100 μL/min向管路中注入甲醇溶液，冲洗管路2 min。

电喷雾离子源(ESI)，正、负离子扫描模式；一级质谱扫描范围m/z50～1 000，二级质谱扫描范围m/z50～1 000；离子喷雾电压5 500/-4 500 kV；喷雾气(GS1)压力30 MPa；辅助加热气(GS2)压力30 MPa；气帘气(CUR)压力25 MPa；离子化温度(TEM)200 ℃；碰撞能量35/-35 eV，碰撞能量扩展(CES)15 eV；去簇电压(DP)40/-40 V。

2 结果与讨论

采用DI-MS/MSALL技术分析枸杞子提取物，得到正、负离子模式下的MS1谱图，分别示于图1a、1c。正离子模式下，主要的MS1信号有m/z126.054 4、149.018 3、180.095 9、205.079 2、279.150 7、301.131 5、317.105 1、579.274 1等；负离子模式下，主要的MS1信号有m/z119.050 5、137.024 4、163.041 0、179.056 0、210.077 0、255.232 9、279.232 6、339.232 0、609.144 5等。采用PeakviewTM软件对数据进行可视化处理，以相对丰度0.1%进行碎片过滤，得到正、负离子模式下MS2碎片离子热图信息，示于图1b、1d。

以负离子模式下m/z255～256质量窗口为例，该窗口产生的碎片离子主要包括m/z165.057 8、137.024 6和119.050 5等，示于图1e。结合MS1谱图可知，该窗口出现唯一的母离子m/z255.232 9，因此将上述碎片离子归属为其子离子，进而实现MS1-MS2数据列表的构建。

根据得到的MS1和MS2信息，并结合Mass-Bank、HMDB、Metlin、PubChem等数据库和相关文献报道的各类化合物的质谱裂解规律，从枸杞子中初步鉴定出38个化合物，包括1个氨基酸类、19个有机酸类、2个糖脂类、6个苯丙素类、1个黄酮类、6个生物碱类以及3个酰胺类化合物，结果列于表1。

2.1 苯丙素类化合物的结构鉴定

从枸杞子中鉴定出6个苯丙素类化合物，包括2个香豆素类化合物(3和8)和4个简单苯丙素类化合物(9、10、22和29)。根据多级质谱数据以及相关文献[18-19]，对2类苯丙素类化合物的质谱裂解途径进行推导，并对MS1、MS2信号进行归属。

注：a,c.MS1谱图；b,d.MS2碎片离子热图；e.m/z 255～256质量窗口的MS2质谱图图1 正(a,b)、负(c,d)离子模式下，枸杞子提取物DI-MS/MSALL的多级质谱图Fig.1 Tandem mass spectra of Lycii Fructus extract collected by DI-MS/MSALL under positive (a,b) and negative (c,d) ion modes

2.1.1香豆素类化合物 香豆素类化合物是以苯骈α-吡喃酮为结构母核，且在α-吡喃酮环上具有羟基、甲氧基、糖基等含氧官能团的取代。负离子模式下，该类化合物的准分子离子通常以[M-H]-形式存在，碎片离子主要通过发生CO(28 u)、CO2(44 u)、葡萄糖残基(C6H10O5，162 u)和鼠李糖残基(C6H10O4，146 u)等基团的中性丢失形成。由于在α-吡喃酮环上常见甲氧基取代，因此，还会进一步丢失甲基自由基(CH3·，15 u)。

以化合物8为例，负离子模式下的MS1谱图显示准分子离子为m/z191.034 8[M-H]-，预测其分子式为C10H8O4(误差为-1×10-6)，主要的碎片离子为m/z176.012 2、148.017 3、120.021 6和104.027 1，其MS2谱图示于图2a。根据预测的元素组成和相关文献[20]，并结合上述质谱裂解规律，对碎片离子的产生途径进行归属，其中丰度最高的碎片离子m/z176.012 2[M-H-CH3·]-·是由母离子脱去甲基自由基(CH3·，15 u)产生的。该碎片离子进一步连续丢失CO(28 u)，产生碎片离子m/z148.017 3[M-H-CH3·-CO]-·和m/z120.021 6[M-H-CH3·-2CO]-·。此外，碎片离子m/z104.027 1[M-H-CH3·-CO2-CO]-·是由m/z176.012 2丢失1分子CO2(44 u)和1分子CO(28 u)生成。根据上述信息，将[M-H]-m/z191.034 8的化合物初步鉴定为东莨菪素(scopoletin)或异东莨菪素(isoscopoletin)。由于枸杞子中存在这对同分异构体，故化合物8的信号是由这对同分异构体同时产生的。以东莨菪素为例，推测的质谱裂解途径示于图2b。

图2 东莨菪素的二级质谱图(a)及其质谱裂解途径(b)Fig.2 MS2 spectrum (a) and proposed fragmentation pathways (b) of scopoletin

2.1.2简单苯丙素类化合物 简单苯丙素类化合物是以C6～C3为基本骨架，一般具有苯酚结构。负离子模式下，该类化合物的准分子离子通常以[M-H]-形式存在。在二级质谱图中，母离子通常会发生H2O(18 u)、CO(28 u)和CO2(44 u)等中性丢失产生碎片离子。此外，由于该类化合物具有酚羟基、羧基等含氧官能团，与糖上的羟基脱水缩合形成苷类化合物，因此，常见糖残基的中性丢失，例如葡萄糖残基(C6H10O5，162 u)和木糖残基(C5H8O4，132 u)等。

以化合物22为例，负离子模式下的MS1谱图显示准分子离子为m/z325.092 3[M-H]-，预测其分子式为C15H18O8(误差为-1.8×10-6)，主要的碎片离子有m/z163.039 2、145.030 3和119.049 9，其MS2谱图示于图3a。根据预测的元素组成和相关文献[20]，并结合上述质谱裂解规律，对碎片离子的产生途径进行归属。其母离子m/z325.092 3[M-H]-首先中性丢失1分子葡萄糖残基(C6H10O5，162 u)产生碎片离子m/z163.039 2[M-H-C6H10O5]-，该碎片离子进一步中性丢失1分子H2O(18 u)产生碎片离子m/z145.030 3[M-H-C6H10O5-H2O]-，或中性丢失1分子CO2(44 u)产生碎片离子m/z119.049 9[M-H-C6H10O5-CO2]-。因此，根据上述信息初步推测[M-H]-m/z325.092 3的化合物为对香豆素-O-葡萄糖苷，其可能的质谱裂解途径示于图3b。

图3 对香豆素-O-葡萄糖苷的二级质谱图(a)及其质谱裂解途径(b)Fig.3 MS2 spectrum (a) and proposed fragmentation pathways (b) of p-coumaric acid-O-glycosides

2.2 生物碱类化合物的结构鉴定

据文献[20]报道，目前已从枸杞子中分离得到72个生物碱类化合物，主要包括莨菪烷类、咪唑类、哌啶类和吡咯类等。本研究从枸杞子中初步鉴定出6个生物碱类化合物，其中包括4个吡咯类生物碱(11～14)、甜菜碱(32)及1个其他类生物碱(33)。通过多级质谱数据推测吡咯类生物碱的质谱裂解途径，并对MS1、MS2信号进行归属。

枸杞子中吡咯类生物碱的基本结构为五元含氮杂环，其吡咯环1位氮原子上存在丁酸、丁酸甲酯等基团取代，且在吡咯环的2位和5位通常具有羟甲基、甲氧基甲基、醛基等基团取代。

该类化合物在负离子模式下的准分子离子峰通常以[M-H]-形式存在，碎片离子主要是由吡咯环1位氮原子处支链的中性丢失产生，例如丁酸基团(C4H6O2，86 u)、丁酸甲酯基团(C5H9O2，100 u)等。此外，由于吡咯环上的2位和5位通常有羟甲基、醛基等基团取代，因此会进一步中性丢失CH2O(30 u)、CO(28 u)等产生相应的碎片离子。

以化合物13为例，负离子模式下的准分子离子为m/z210.077 0[M-H]-，预测其分子式为C10H13NO4(误差为-0.9×10-6)，主要的碎片离子有m/z124.040 0、94.029 8和66.034 6，其MS2谱图示于图4a。结合预测的元素组成和上述质谱裂解规律，对碎片离子的产生途径进行归属，碎片离子m/z124.040 0[M-H-C4H6O2]-是由母离子在吡咯环上N原子处发生断裂丢失C4H6O2(86 u)形成的，该碎片离子继而丢失CH2O(30 u)、CO(28 u)，分别得到碎片离子m/z94.029 8[M-H-C4H6O2-CH2O]-和m/z66.034 6[M-H-C4H6O2-CH2O-CO]-。此外，其母离子还可脱去1分子甲酸(46 u)产生碎片离子m/z164.040 8[M-H-HCOOH]-。因此，参考相关文献[20]以及数据库检索，初步推测[M-H]-m/z210.077 0为4-[2-甲酰基-5-(羟甲基)-1H-吡咯-1-基]-丁酸，其可能的质谱裂解途径示于图4b。

图4 4-[2-甲酰基-5-(羟甲基)-1H-吡咯-1-基]-丁酸的二级质谱图(a)及其质谱裂解途径(b)Fig.4 MS2 spectrum (a) and proposed fragmentation pathways (b) of 4-[2-formyl-5-(hydroxymethyl)-1H-pyrrol-1-yl]-butanoic acid

2.3 酰胺类化合物的结构鉴定

本研究基于DI-MS/MSALL技术从枸杞子中鉴定出3个酰胺类化合物，包括1个非多胺型酚酰胺类化合物(36)和2个亚精胺型酚酰胺类化合物(37和38)。根据该类化合物的多级质谱数据以及相关文献[21]推测其质谱裂解途径，并对各MS1、MS2信号进行归属。

2.3.1非多胺型酚酰胺类化合物 非多胺型酚酰胺大多具有酪胺结构，正离子模式下的裂解首先主要发生在酰胺键处，中性丢失酪胺分子(C8H11NO，137 u)产生正离子信号，如咖啡酰基(m/z163)、二氢咖啡酰基(m/z165)等。由于其结构上存在羟基、甲氧基等取代基团，因此经酰胺键断裂产生的正离子信号会进一步发生CO(28 u)、H2O(18 u)、CH3·(15 u)、CH3OH(32 u)等基团丢失。

以化合物36为例，正离子模式下的MS1谱图显示准分子离子峰为m/z314.138 4[M+H]+，预测其分子式为C18H19NO4(误差为-0.8×10-6)，主要的碎片离子有m/z177.048 4、162.084 5和121.060 5等，其MS2谱图示于图5a。根据预测的元素组成并结合上述质谱裂解规律，对碎片离子的产生途径进行推测。由于该类化合物结构中大多具有酪胺结构，容易在酰胺键处断裂脱去1分子酪胺(C8H11NO，137 u)产生m/z177.048 4[M+H-C8H11NO]+碎片离子，该碎片离子进一步脱去1分子CO(28 u)和甲基自由基(CH3·，15 u)，分别产生碎片离子m/z149.054 9[M+H-C8H11NO-CO]+和162.084 5[M+H-C8H11NO-CH3·]+·。此外，酪胺侧C-N键断裂产生碎片离子m/z121.060 5[M+H-C10H11NO3]+。根据上述信息推测[M+H]+m/z314.138 4为N-反式阿魏酰酪胺，其可能的质谱裂解途径示于图5b。

图5 N-反式阿魏酰酪胺的二级质谱图(a)及其质谱裂解途径(b)Fig.5 MS2 spectrum (a) and proposed fragmentation pathways (b) of N-trans-feruloyl tyramine

2.3.2亚精胺型酚酰胺类化合物 亚精胺型酚酰胺是以亚精胺为结构骨架，含有2个氨基和1个亚氨基，且多具有咖啡酰基(m/z163)、二氢咖啡酰基(m/z165)等基团。与非多胺型酚酰胺一致，亚精胺型酚酰胺首先在酰胺键处发生断裂得到酰基正离子，进一步发生CO(28 u)中性丢失。氨基侧正离子则在氨基处发生一系列中性丢失，如NH3(17 u)、C4H9N(71 u)、CO(28 u)、C3H6(42 u)、CH3N(29 u)等[21]。

以化合物37为例，正离子模式下的准分子离子为m/z472.243 8[M+H]+，预测化合物的分子式为C25H33N3O6(误差为-0.8×10-6)，主要的碎片离子有m/z310.201 7、293.176 0、220.089 4、163.032 9等，其MS2谱图示于图6a。由于该类化合物的结构骨架为亚精胺，其中含有2个氨基和1个亚氨基，可在酰胺键处断裂产生m/z163.032 9[M+H-C16H27N3O3]+和m/z310.201 7[M+H-C9H6O3]+碎片离子。碎片离子m/z310.201 7进而在氨基处发生断裂，中性丢失NH3(17 u)形成碎片离子m/z293.176 0[M+H-C9H6O3-NH3]+；而碎片离子m/z220.089 4[M+H-C13H20N2O3]+则是由母离子在亚氨基侧C—C键断裂形成。因此，根据上述信息推测[M+H]+m/z472.243 8为N1-咖啡酰-N3-二氧咖啡酰亚精胺，其可能的质谱裂解途径示于图6b。

图6 N1-咖啡酰-N3-二氧咖啡酰亚精胺的二级质谱图(a)及其质谱裂解途径(b)Fig.6 MS2 spectrum (a) and proposed fragmentation pathways (b) of N1-caffeoyl-N3-dihydrocaffeoyl spermidine

3 结论

本研究采用DI-MS/MSALL技术表征枸杞子化学成分组，共鉴定出38个化合物，可为枸杞子药材的进一步开发和利用提供参考。该技术将直接注射质谱高通量优势与Q-TOF MS高灵敏度、高分辨率、强特异性的优势结合，实现中药复杂体系化学成分的快速分析，为中药定性分析和质量评价提供有效的分析工具。但DI-MS/MSALL技术也存在一定的局限性，当设定的检测窗口中存在同分异构体时，无法对其子离子进行归属，难以区分中药中广泛存在的同分异构体类化合物。将该方法与常用的同分异构体区分方法联用，如在线能量分辨质谱等[22]，可提高中药化学成分轮廓分析的准确性。