基于多成分序贯代谢的石榴皮中枢神经系统保护作用物质基础研究

江晓泉，杨文宁，森慕黎，罗志强，李雪岩，陈洪娇，刘 伟，祁东盈，汪国鹏，刘 洋

(1.北京中医药大学中药学院，北京 102488；2.北京中医药大学生命科学学院，北京 102488；3.中财瀚熙(北京)生物科技发展有限公司，北京 101503)

石榴皮为石榴科植物石榴(PunicagranatumL.)的干燥果皮，具有涩肠止泻、止血、驱虫的功效，用于治疗久泻、久痢、便血、脱肛、崩漏、白带、虫积腹痛等病症[1]。现代研究表明[2]，石榴皮含有鞣质类、黄酮类、酚酸类、生物碱类和氨基酸类等化学成分，具有抑制大脑内脂质过氧化、减轻氧化应激、改善空间记忆、改善阿尔兹海默症等作用[3-5]。但尚未有研究对其中枢神经系统保护作用的物质基础进行探究。

血脑屏障是限制中枢神经系统疾病药物发挥药效的主要因素之一[6]。中药在中枢神经系统保护方面具有不良反应少、作用温和持久等优势，但由于中药多成分、多靶点的特点，难以评估血脑屏障通过效应。基于此，本研究以石榴皮为研究对象，拟基于多成分药物代谢理论[7]，借助UPLC-Q-Exactive MS检测手段，首先通过肠灌流和封闭肠环给药的方法，考察石榴皮的肠吸收及代谢情况，过滤掉一部分未吸收成分，并鉴定出新生成的代谢产物；在肠代谢成分鉴定的基础上，模拟口服给药的方式对大鼠进行灌胃，解析血中移行成分；最后，分析鉴定灌胃给药后大鼠脑脊液样品中石榴皮的成分及其代谢产物。结合多成分药物序贯代谢方法，逐步解析石榴皮及其代谢产物在大鼠体内的移行，靶向识别出石榴皮的入脑成分，希望为阐述石榴皮治疗中枢神经系统疾病的药效物质基础提供依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

UltiMate 3000-Q-Orbitrap：美国Fisher公司产品，配有UltiMate 3000 超高效液相色谱仪、Q-Exactive 四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪、DAD检测器、Xcalibur质谱工作站；BSA2202S电子分析天平：德国Sartorius公司产品；BT-100-1F蠕动泵、LSP02-1B注射泵：保定兰格恒流泵有限公司产品；KQ5200E超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司产品；HH-2A电热恒温水浴锅：北京科伟永兴仪器有限公司产品；1-15PK高速冷冻离心机：德国Sigma公司产品；CM-12水浴氮吹仪：北京成萌伟业科技有限公司产品。

1.2 药物与试剂

石榴皮饮片：购于北京同仁堂长阳药店有限公司新悦都店，由北京中医药大学王晶娟教授鉴定为石榴科植物石榴PunicagranatumL.的干燥果皮；甲醇、乙腈(色谱纯)，乙腈、甲酸(质谱纯)：美国赛默飞世尔科技有限公司产品；磷酸(色谱纯)：天津市光复精细化工研究所产品；无水乙醇(分析纯)：天津大茂化学试剂厂产品；氯化钠注射液：石家庄四药有限公司产品；医用胶：北京康派特医疗器械有限公司产品；水合氯醛(分析纯)：福晨天津化学试剂有限公司产品；肝素钠注射液：上海上药第一生化药业有限公司产品；屈臣氏饮用水：广州屈臣氏食品饮料有限公司产品；Oasis HLB C18固相萃取柱：美国Waters公司产品。

1.3 实验动物

SD雄性大鼠(SPF级，体质量220～250 g，合格证号SCXK(京)2019-0010)：购于斯贝福(北京)生物技术有限公司，已通过北京中医药大学伦理部的伦理审批(审批号BUCM-4-2019060515-1028)。将大鼠饲养于昼夜节律光照条件下(温度25～27 ℃，相对湿度50%～70%)，实验前适应性饲养14天，自由进食进水。

1.4 实验方法

1.4.1石榴皮提取液的制备 称取179.99 g石榴皮粉末，加入1.8 L 50%乙醇，室温浸提30 min，以4 000 r/min离心10 min，取上清液，于50 ℃水浴挥至近180 mL，得到约1 g/mL石榴皮提取液，稀释1 000倍，过0.22 μm微孔滤膜，待测。

1.4.2肠代谢成分鉴定 肠壁代谢组(肠灌流)：随机选取4只禁食(不禁水)12 h的大鼠，腹腔注射10%水合氯醛，腹主动脉采血，并于37 ℃水浴加热，用于补充手术过程中损失的血液。另取禁食的大鼠，麻醉，沿腹中线剪开腹腔，选择十二指肠以下约10 cm的空肠作为供试肠段，先用37 ℃生理盐水缓慢冲出肠内容物至流出液澄清，继续充入空气将生理盐水排净。将石榴皮提取液注入肠段，末端开口排出，通过注射泵控制流速0.2 mL/min。用37 ℃生理盐水润湿的纱布覆盖在裸露肠段上，保温灯加热。剖离颈静脉，插入静脉留滞针，通过蠕动泵连接到盛有供血的离心管中；在肠系膜静脉插入充满肝素钠的静脉留滞针，结扎周围多余血管，另一端通过蠕动泵收集血液至干净离心管，结扎肝门静脉。开启蠕动泵，以流速0.3 mL/min进行颈静脉输血，肠系膜静脉连续采血2 h后处死大鼠。对照组注射泵给予生理盐水，其余操作相同。

肠道菌群代谢组(封闭肠环)：大鼠麻醉后选取盲肠以下约8 cm的结肠作为供试肠段，将石榴皮提取液注入肠腔，当药液到达肠段末端，用手术线结扎，并结扎药液进口处。结扎肝门静脉，颈静脉供血，肠系膜静脉采血，其余操作同“肠壁代谢组”。采血2 h后处死大鼠。对照组注射泵给予生理盐水，其余操作相同。

1.4.3综合代谢成分鉴定 选取3只SD雄性大鼠，每天早、晚均灌胃2 mL石榴皮提取液，连续灌胃3天，第4天上午给药1 h后，腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉处理，采集脑脊液后，腹主动脉采血。空白组给予生理盐水。

1.4.4血液样品处理 将收集的血液样品于4 ℃以4 000 r/min离心10 min，分离得到血浆后，分别用以下2种方法处理：1) 固相萃取柱法：取1.5 mL血浆样品，加入等体积的4%磷酸溶液混合，涡旋2 min，静置5 min后上样于SPE柱，分别使用5%甲醇和水冲洗SPE柱，乙腈-甲醇溶液(90∶10，V/V)进行洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，1 mL甲醇复溶，过0.22 μm微孔滤膜，待液相色谱-质谱分析。2) 有机试剂沉淀法：取1 mL血浆样品，加入等体积的乙腈混合，涡旋2 min，于4 ℃下以10 000 r/min离心10 min，吸取上清液，过0.22 μm微孔滤膜，待液相色谱-质谱分析。

1.4.5脑脊液样品处理 向综合代谢组的脑脊液样品中加入等体积的乙腈混合，涡旋2 min，于4 ℃下以10 000 r/min离心10 min，吸取上清液，待液相色谱-质谱分析。

1.4.6色谱条件 色谱柱：Acquity UPLC BEH Shield RP C18柱(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)；体积流量0.3 mL/min；进样体积5 μL；流动相：0.1%甲酸(A)-乙腈(B)；梯度洗脱：0～2 min(95%A)，2～17 min(95%～2%A)，17～20 min(2%A)，20～23 min(2%～95%A)，23～25 min(95%A)；柱温40 ℃。

1.4.7质谱条件 电喷雾电离源(ESI)，正、负离子检测模式；质量扫描范围m/z100～1 500；喷雾电压+3.5 kV(正离子模式)、-3.0 kV(负离子模式)；鞘气压力35 Pa；辅助气压力15 Pa；辅助气温度300 ℃；离子传输管温度350 ℃；Full MS/dd-MS2扫描模式，Full MS分辨率70 000，dd-MS2分辨率17 500；碰撞能量20、40、60 eV。

2 结果与讨论

2.1 石榴皮提取液中化学成分鉴定

石榴皮提取液的总离子流图示于图1。利用Thermo Xcalibur Qual Browser软件与OTCML、HMDB数据库比对，并结合参考文献，共鉴定出38个化合物，结果列于表1。

注：a.负离子模式；b.正离子模式图1 石榴皮提取液的总离子流图Fig.1 Total ion current chromatograms of Punica granatum L.extract

2.1.1鞣质类化合物鉴定 从石榴皮提取液中共鉴别出六羟基联苯二甲酰基葡萄糖苷、安石榴苷和鞣云实精等17个鞣质类化合物。下面以安石榴苷和鞣云实精为例进行质谱解析。

化合物M12、M15和M18的准分子离子分别为m/z1 083.059 8[M-H]-、m/z1 083.058 5[M-H]-、m/z1 083.058 3[M-H]-，Qual Browser软件给出的精确分子式均为C48H27O30(误差分别为1.518×10-6、0.281×10-6、0.170×10-6)，二级碎片离子为m/z781[M-H-ellagic acid]-、m/z601[M-H-ellagic acid-162-H2O]-和m/z301[ellagic acid-H]-，表明3个化合物的结构中均包含安石榴林和鞣花酸。通过与文献[8,12-13]比对，推测M12、M15、M18为安石榴苷的3个同分异构体。

化合物M21的准分子离子为m/z633.073 6[M-H]-，Qual Browser软件给出的精确分子式为C27H21O18(误差为2.164×10-6)，二级碎片离子有m/z463[M-H-170]-、m/z301[M-H-170-162]-，分别为失去1分子没食子酸，1分子没食子酸和1分子葡萄糖基的碎片离子，此外还产生m/z257、229碎片离子，表明M21中存在六羟基联苯二甲酰基基团和没食子酸结构。与文献[8]对比，推测其为鞣云实精。

2.1.2黄酮类化合物鉴定 从石榴皮提取液中共鉴定出芦丁、槲皮素、金丝桃苷等7个黄酮类化合物。下面以槲皮素为例进行质谱解析。

化合物M33的准分子离子为m/z303.050 0[M+H]+，Qual Browser软件给出的精确分子式为C15H11O17(误差为0.201×10-6)，二级碎片离子有m/z285[M+H-H2O]+、m/z275[M+H-CO]+、m/z257[M+H-H2O-CO]+、m/z247[M+H-2CO]+、m/z229[M+H-2CO-H2O]+、m/z213[M+H-2CO-O-H2O]+和m/z201[M+H-3CO-H2O]+。经与文献[17]比对，推测该化合物为槲皮素，其裂解途径示于图2。

图2 槲皮素的裂解途径Fig.2 Fragmentation pathways of paeoniflorin quercetin

2.1.3酚酸类化合物鉴定 从石榴皮提取液中鉴定出儿茶素、没食子酸和鞣花酸等9个酚酸类化合物。下面以没食子酸、没食子酸乙酯和鞣花酸及其糖苷为例进行质谱解析。

化合物M7和M25的准分子离子分别为m/z169.013 4[M-H]-、m/z197.045 0[M-H]-，Qual Browser软件给出的精确分子式为C7H5O5和C9H9O5(误差为1.185×10-6、2.690×10-6)。M7的二级碎片离子有m/z125[M-H-COO]-，为丢失1分子羧基形成的；M25的二级碎片离子m/z169[M-H-C2H4]-为丢失1分子乙基形成的，m/z125[M-H-C2H4-COO]-为丢失1分子乙基、1分子羧基形成的。结合文献[9]，推测M7和M25分别为没食子酸、没食子酸乙酯，其裂解途径示于图3。

图3 没食子酸、没食子酸乙酯的裂解途径Fig.3 Fragmentation pathways of gallic acid and ethyl gallate

化合物M23、M27、M29和M31的准分子离子分别为m/z463.052 2[M-H]-、m/z433.041 5[M-H]-、m/z447.057 3[M-H]-和m/z300.998 7[M-H]-，Qual Browser软件给出的精确分子式为C20H15O13、C19H13O12、C20H15O12和C14H5O8(误差为3.311×10-6、3.043×10-6、3.440×10-6和0.806×10-6)。M31的二级碎片离子有m/z300[M-H]-、m/z284[M-H-OH]-、m/z257[M-H-COO]-、m/z229[M-H-COO-CO]-，与文献[15]报道一致，推测化合物M31为鞣花酸，其质谱裂解途径示于图4。化合物M23、M27和M29的碎片离子有m/z301、300、257、229等，表明这3个化合物结构中可能存在鞣花酸，其中m/z301碎片离子分别为[M-H-162]-(M23)，[M-H-132]-(M27)和[M-H-146]-(M29)，结合文献[8,13]，推测其分别由M23、M27、M29失去1分子葡萄糖、1分子戊糖、1分子鼠李糖后形成的，即M23、M27、M29分别为鞣花酸葡萄糖苷、鞣花酸戊糖苷和鞣花酸鼠李糖苷。

图4 鞣花酸的裂解途径Fig.4 Fragmentation pathways of ellagic acid

2.1.4异香豆素类化合物鉴别 从石榴皮提取液中鉴定出3个异香豆素类化合物，以云实素为例进行结构鉴定。

化合物M24的准分子离子为m/z247.024 8[M-H]-，Qual Browser软件给出的精确分子式为C12H7O6(误差为4.435×10-6)，二级碎片离子有m/z219、201、191、173和117，其中m/z219[M-H-CO]-和m/z191[M-H-2CO]-分别为失去1分子羰基和2分子羰基的碎片离子，与文献[9]比对，推测该化合物为云实素。

2.1.5其他类别化合物鉴定 从石榴皮提取液中还鉴定出柠檬酸与熊果酸。化合物M3的准分子离子为m/z191.018 9[M-H]-，Qual Browser软件给出的精确分子式为C6H7O7(误差为1.419×10-6)，二级碎片离子有m/z129、111、87和85。通过与OTCML数据库对比，推测该化合物为柠檬酸。

化合物M38的准分子离子为m/z455.353 1[M-H]-，Qual Browser软件给出的精确分子式为C30H47O3(误差为1.419×10-6)，二级碎片离子有m/z409[M-H-HCOOH]-和m/z407[M-H-CH4O2]-。通过参考文献[18]，因其同分异构体齐墩果酸无m/z409碎片离子，推断M38可能为熊果酸。

2.2 原型入血成分鉴定

对肠代谢血浆样品中原型入血成分进行统计，从血浆样品中共检测到30个石榴皮原型入血成分，肠壁代谢组和肠道菌群代谢组的血浆样品中检测到的原型入血成分无差别，表明它们可通过肠壁吸收；综合代谢组血浆样品中共检测到7个原型入血成分，且均为肠吸收入血成分，详细情况列于表2。

表2 石榴皮原型入血成分Table 2 Prototype constituents into blood of Punica granatum L.

实验结果表明，除鞣花酸、鞣质类成分外，黄酮类、酚酸类和异香豆素类等成分均能以原型吸收入血，原型入血成分多达30个，但综合代谢组血浆样品的原型入血成分仅有7个。这可能是因为灌胃给药量较少，部分含量低的入血成分不足以被检测到；此外，由于灌胃后定点采血，部分成分因吸收慢尚未进入血液，或成分吸收、代谢、排泄快，以代谢产物形式存在于血液循环中或排出体外，导致血液中检测不到原型入血成分。

通过肠道灌流和封闭肠环的方法能够过滤掉一部分未被吸收的成分，降低综合代谢成分鉴定的工作量，同时也是对定点灌胃采血遗漏成分的补充，可提高血中移行成分鉴定的全面性和准确性。

2.3 代谢产物鉴定

在肠壁代谢组与肠道菌群代谢组血浆样品中鉴定出12个相同的代谢产物，列于表3，两组代谢产物结果基本无差异。目前尚未见关于肠壁细胞对石榴皮代谢作用的研究，除肠道菌群外，肠壁代谢作用对石榴皮代谢极为重要，但由于实验只能定性判断代谢成分，不排除灌流实验中有残存的肠道菌群介导代谢的可能。

在肠壁代谢组、肠道菌群代谢组和综合代谢组血浆样品中共鉴定出18种代谢产物，包括山柰酚、没食子酸甲酯、鞣花酸的甲基化和葡萄糖醛酸化或糖苷化、尿石素A及其硫酸化物、尿石素C和尿石素D的甲基化物与糖基化物，详细信息列于表3。除山柰酚外，主要代谢成分是通过安石榴苷、安石榴林等鞣质类代谢产生，结合文献[9,19]分析其代谢方式，示于图5。以安石榴苷为代表的石榴皮鞣质类成分主要代谢途径包括水解、还原、甲基化、葡萄糖醛酸化和硫酸化。

图5 石榴皮中主要鞣质类成分代谢途径Fig.5 Metabolic pathways of the main tannins in Punica granatum L.

代谢产物中含有多种鞣花酸和鞣质类成分的代谢产物，这与药典[1]含量测定考察项相符，表明鞣花酸及鞣质类是保证药效的重要成分。据文献[9,19-20]报道，石榴皮中的鞣质类成分在肠道菌群作用下能代谢生成尿石素类成分，与其前体化合物相比更容易被吸收，且被证实在体内外具有抗炎、抗氧化、抗癌、调节脂质代谢和保护胃肠道等多种活性[21-22]。综合代谢组血浆中检测到了尿石素C、尿石素C葡萄糖醛酸化物、尿石素C双葡萄糖醛酸化物、尿石素A、尿石素A硫酸化物、尿石素A葡萄糖醛酸化物；在肠壁代谢组和肠道菌群代谢组的代谢产物中发现了甲基尿石素D葡萄糖醛酸化物、尿石素A葡萄糖醛酸化物。综合代谢组检测到的尿石素类成分较肠代谢组多，这可能与生成尿石素代谢物所需的时间较长有关，综合代谢组连续灌胃给药3天，尿石素类成分被检测到的几率更高；此外，由于灌胃给药时体内肠道封闭，此时的厌氧环境更利于肠道菌群生长。

2.4 入脑成分鉴定

对综合代谢组脑脊液样品进行鉴定，共检测到6个成分。柠檬酸和鞣花酸均能以原型入脑；此外，2个甲基鞣花酸同分异构体、二甲基鞣花酸和二甲基鞣花酸葡萄糖醛酸化物也能在脑脊液中检测到。脑脊液样品的质谱结果显示，检测到的化合物响应值均较小，大部分入脑成分无二级结构。在肠代谢组、综合代谢组血中移行成分鉴定结果的基础上，根据脑脊液样品中不同成分的分子离子峰和保留时间进行鉴别，可有效提高质谱解析的效率和鉴定结果的全面性、准确性。

体内外实验发现，鞣花酸可有效逆转创伤性脑损伤引起的记忆障碍[24]，并能抑制细胞凋亡、炎症反应，下调JNK/p38MAPK活性，对缺氧缺血性脑损伤起到神经保护作用[25]。此外，鞣花酸及其甲基衍生物是有效的自由基清除剂[26]，其甲基衍生物还可诱导神经球干细胞向神经元分化[27]，表明筛选出的入脑成分是石榴皮发挥中枢神经系统保护作用的重要成分。

3 结论

将序贯代谢法与超高效液相色谱-串联质谱相结合，研究了石榴皮中发挥中枢神经系统保护作用的物质基础。从石榴皮提取液中鉴定出38个化学成分，其中30个成分经肠吸收以原型入血；并检测到18个代谢产物，主要为安石榴苷、安石榴林等鞣质类经水解、还原、甲基化、葡萄糖醛酸化和硫酸化等反应产生。筛选出6个入脑成分，柠檬酸、鞣花酸以原型入脑，经代谢生成的2个甲基鞣花酸同分异构体、二甲基鞣花酸和二甲基鞣花酸葡萄糖醛酸化物也能透过血脑屏障入脑。该研究基于多成分药物代谢理论，将序贯代谢法与液相色谱-质谱联用技术相结合，靶向识别出石榴皮及其代谢产物中入脑成分，为多成分药物治疗中枢神经系统疾病的物质基础研究提供了思路。